18
Ket: ST Salmonella Typhimurium; SS Shigella sonnei
Gambar 8. Diagram alir tahapan penelitian
a. Tahapan Pra-penelitian
1. Persiapan Bahan Kimia
Bahan kimia yang disiapkan untuk penelitian ini diantaranya adalah larutan pengencer NaCl 0,85, lisozim, proteinase K, CTAB, dan buffer TE pH 8,0. Pembuatan NaCl 0,85
dilakukan dengan melarutkan 4,25 gram kristal NaCl ke dalam 500 ml milliQ di dalam labu ukur dan diaduk hingga homogen. Lisozim dibuat dengan melarutkan 10 mgml lisozim
dengan 25 ml larutan Tris.HCl 10 mM pH 8,0 dan dikocok sampai jernih. Pembuatan proteinase K dilakukan dengan melarutkan 10 mgml proteinase K dengan 25 ml Tris.HCl
10 mM pH 8,0 dan diaduk sampai jernih. Cetyl trimethilammonium bromide
CTAB dibuat dengan melarutkan 10 gram CTAB, 41 gram NaCl, dan 7,87 gram HCl ke dalam 400 ml akuades. Kemudian larutan tersebut
ditambah dengan NaOH sampai larutan mencapai pH 8,0 dan ditambah dengan 20 ml EDTA Pengujian dengan Real-Time PCR
Pengkuantifikasian ST pada Susu Pengecekan
IsolasiEkstraksi DNA
Metode Pendidihan Metode Kit Komersial
IsolatTemplate DNA
IsolatTemplate DNA
Kultur Murni ST SS
Inokulasi Sampel Susu
UHT spike
Pengujian dengan Real-Time PCR 1. Penentuan Konsentrasi Primer
2. Penentuan Spesifisitas Primer 3. Pengkuantifikasian ST pada Susu
Kultur Murni ST SS
19 0,5 M pH 8,0. Larutan tersebut dituang ke dalam labu ukur 500 ml dan ditera dengan
akuades. Larutan dipindahkan ke dalam erlenmeyer, divortex sampai larut kemudian dilakukan degasing penghilangan gas dari larutan. Larutan tersebut selanjutnya disaring
dengan kertas saring dan disterilisasi dengan autoclave dan disimpan pada suhu ruang. Bahan kimia lainnya yang disiapkan adalah buffer TE pH 8,0. Buffer TE pH 8,0 dibuat
dengan mencampurkan 5 ml Tris.HCl 1 M pH 8,0 dengan 1 ml EDTA 0,5 M ke dalam labu ukur 500 ml dan ditambahkan milliQ sampai tanda tera. EDTA 0,5 M pH 8,0 diperoleh
dengan menimbang 18,6 gram EDTA Titriplex
®
; C
10
H
14
Na
2
O
8
.2H
2
O dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml kemudian ditambahkan dengan 80 ml milliQ sedikit demi sedikit.
Larutan tersebut ditambah dengan NaOH sampai larutan tersebut memiliki pH 8,0. Larutan kemudian ditera dan disterilisasi dengan autoclave. Seluruh proses pembuatan tersebut dapat
dilihat pada Lampiran 1a, b, c, d, dan e.
2. Persiapan Media Tumbuh Mikroba
Kategori