19 0,5 M pH 8,0. Larutan tersebut dituang ke dalam labu ukur 500 ml dan ditera dengan
akuades. Larutan dipindahkan ke dalam erlenmeyer, divortex sampai larut kemudian dilakukan degasing penghilangan gas dari larutan. Larutan tersebut selanjutnya disaring
dengan kertas saring dan disterilisasi dengan autoclave dan disimpan pada suhu ruang. Bahan kimia lainnya yang disiapkan adalah buffer TE pH 8,0. Buffer TE pH 8,0 dibuat
dengan mencampurkan 5 ml Tris.HCl 1 M pH 8,0 dengan 1 ml EDTA 0,5 M ke dalam labu ukur 500 ml dan ditambahkan milliQ sampai tanda tera. EDTA 0,5 M pH 8,0 diperoleh
dengan menimbang 18,6 gram EDTA Titriplex
®
; C
10
H
14
Na
2
O
8
.2H
2
O dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml kemudian ditambahkan dengan 80 ml milliQ sedikit demi sedikit.
Larutan tersebut ditambah dengan NaOH sampai larutan tersebut memiliki pH 8,0. Larutan kemudian ditera dan disterilisasi dengan autoclave. Seluruh proses pembuatan tersebut dapat
dilihat pada Lampiran 1a, b, c, d, dan e.
2. Persiapan Media Tumbuh Mikroba
Media tumbuh yang digunakan baik untuk Salmonella Typhimurium maupun Shigella sonnei
adalah Heart Infusion Broth HIB dan Xylose Lysine Deoxycholate Agar XLDA. Media HIB dibuat dengan melarutkan 18,5 gram HIB dengan 500 ml akuades dan diaduk
sampai homogen. Setiap 5 ml larutan HIB dipipet ke dalam tabung reaksi steril dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil kemudian disterilisasi dalam autoclave. Media XLDA
dibuat dengan melarutkan 27,75 gram XLDA ke dalam 500 ml akuades steril di dalam erlenmeyer steril. Kemudian larutan tersebut dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih
dan larut sempurna tetapi tidak sampai over heat. Setelah itu didinginkan sampai suhu 50
o
C dan masing-masing sebanyak 25 ml dituang ke dalam cawan petri steril. Proses tersebut
dapat dilihat lebih jelas pada Lampiran 2a, b.
b. Tahapan Penelitian
1. Pengecekan Kemurnian Salmonella Typhimurium dan Shigella
sonnei
Masing-masing bakteri Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei pada media Heart Infusion Broth
HIB yang disimpan dalam refrigerator diinokulasi sebanyak 1 ose ke dalam HIB baru kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Jika HIB yang telah diinkubasi tersebut menjadi keruh, selanjutnya HIB tersebut digores kuadran pada media
Xylose Lysine Deoxycholate Agar XLDA yang berbeda, kemudian diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37
o
C. Satu koloni Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei spesifik yang tumbuh pada XLDA diinokulasikan kembali ke dalam media HIB baru yang berbeda pula
dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
2. Inokulasi Sampel Pangan Susu UHT dengan Kultur Murni
Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei
Sebanyak 100 µl kultur murni Salmonella Typhimurium maupun Shigella sonnei yang telah dicek kemurniannya kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml larutan pengencer NaCl
0,85. Kemudian suspensi tersebut dihitung banyaknyakonsentrasi mikroba yang terkandung di dalamnya secara mikroskopi dengan petroff-hausser. Jika konsentrasi suspensi
tersebut kurang dari 10
5
selml maka suspensi ditambah kembali dengan kultur murni hingga konsentrasi suspensi mencapai 10
5
selml, namun jika konsentrasi suspensi lebih dari
20 10
5
selml maka dilakukan pengenceran pada suspensi tersebut dengan menggunakan larutan pengencer NaCl 0,85 sampai didapatkan suspensi dengan konsentrasi 10
5
selml. Sebanyak 5 ml suspensi dengan konsentrasi 10
5
selml tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml susu UHT dan dikocok hingga homogen. Kemudian sampel susu UHT tersebut
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Untuk mengetahui jumlah mikroba akhir Salmonella
Typhimurium yang terkandung pada susu UHT, maka sampel susu UHT ditumbuhkan dan dihitung dengan metode konvensional pada media Xylose Lysine
Deoxycholate Agar XLDA yang diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Sebelumnya untuk mengetahui jumlah mikroba Salmonella Typhimurium natural pada susu UHT, maka
dilakukan penghitungan jumlah mikroba awal dengan menginokulasi 1 ml susu pada media XLDA dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3. IsolasiEkstraksi DNA Mikroba
