10 ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, misalnya adalah 1 menit untuk
setiap 1000 bp. Selain ketiga proses tersebut umumnya tahap kerja PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan
berikut:
1. Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktivasi DNA Polimerase jenis hot-startaktif jika dipanaskan terlebih dahulu.
2. Final Elongasi
Umumnya dilakukan pada suhu optimum enzim 70-72
o
C. Tahap ini dilakukan selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. Proses amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycler yang dapat
menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya untuk melakukan proses tersebut digunakannya tiga penangas air water bath untuk melakukan
melting , annealing dan extention secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya
menggunakan tangan. Tetapi sekarang mesin thermal cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Secara teoritis, PCR dapat mengamplifikasi satu salinan DNA menjadi satu juta kali dalam waktu kurang dari 2 jam Gambar 3. maka berpotensi untuk mengurangi bahkan menghilangkan kebutuhan
untuk pengayaan kultur, namun kehadiran inhibitor dalam pangan dan dalam berbagai media kultur dapat mencegah terikatnya primer dan mengurangi efisiensi amplifikasi sehingga sangat sensitif
dicapai dengan PCR dan kultur murni sering berkurang bila menguji pangan. Oleh karena itu, beberapa pengayaan kultur diperlukan sebelum dilakukannya analisis.
Gambar 3. Jumlah DNA yang dihasilkan dari proses amplifikasi Anonim 2009 Komponen lain yang dibutuhkan untuk pengujian ini selain template DNA yang akan digandakan
dan enzim DNA polimerase, diantaranya adalah:
1. Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. PCR hanya mampu
11 menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp, dan dengan teknik
tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan
template DNA, sehingga dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Langkah pertama dalam perancangan primer adalah mencarimembuat urutan DNAgen yang
diinginkan, umumnya dapat menggunakan basis data umum seperti NCBI. Setelah urutan DNAgen yang diinginkan diperoleh, kemudian software untuk merancang primer digunakan
untuk mempermudah dan memaksimalkan keberhasilan dalam merancang primer. Langkah berikutnya adalah mempertimbangkan dengan hati-hati daerah gen yang akan digunakan sebagai
template DNA. Gen yang memiliki struktur sekunder atau urutan nukleotida yang panjang harus dihindari dalam perancangan primer Pestana et al. 2010.
Besarnya konsentrasi dari primer yang digunakan merupakan hal yang menentukan keberhasilan pengujian. Jika konsentrasi primer pada pengujian dengan real-time PCR yang
digunakan terlalu tinggi, maka akan meningkatkan kesempatan untuk terjadinya mispriming yang artinya akan menghasilkan produk PCR yang tidak spesifik karena primer berikatan tidak hanya
dengan gen target, tetapi dengan gen-gen lainnya pada template DNA yang ditambahkan Pestana et al.
2010, namun jika konsentrasi primer yang digunakan terlalu rendah, maka akan dihasilkan suatu metode pengujian yang tidak sensitif yang menyebabkan terjadinya false-negative dimana
sampel yang positif mengandung gen target akan terdeteksi negatif Lee et al. 2006. Oleh karena itu penentuan konsentrasi primer sangat dibutuhkan dalam pengujian dengan real-time
PCR.
2. dNTP deoxynucleoside triphosphate
dNTP atau building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas empat macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
3. Buffer PCR
