33 Kurva amplifikasi yang dihasilkan oleh real-time PCR menunjukkan bahwa kontrol negatif tidak
teramplifikasi dan bakteri uji teramplifikasi dengan nilai Threshold Cycle Ct sebesar 12,37. Hal tersebut menandakan bahwa primer yang digunakan spesifik untuk Salmonella. Proses amplifikasi
tersebut mencirikan bahwa forward dan reverse primer yang ditambahkan dapat berikatan dan bereplikasi dengan sejumlah sekuen nukleotida di dalam gen target InvA yang hanya terdapat pada
Salmonella khususnya serovar Typhimurium.
Selain menganalisis kurva amplifikasi amplification curve, pengujian spesifisitas primer juga dilakukan dengan menganalisis kurva puncak pelelehan melt peak curve dengan melihat titik
puncak pelelehan melt peak dan nilai Tm Melting Temperature yang dihasilkan pada kurva tersebut.
Kurva puncak pelelehan menunjukkan bahwa kontrol positif Salmonella Typhimurium hanya menghasilkan satu puncak. Hal tersebut menunjukkan bahwa pada pengujian tersebut tidak terjadi
mispriming yang artinya primer yang digunakan spesifik dan tidak mengamplifikasi gen lain selain
gen target. Nilai Tm yang dihasilkan sebesar 84,50
o
C. Nilai tersebut dapat menjadi ciri khusus bagi Salmonella
Typhimurium pada pengujian selanjutnya. Selain itu kurva tersebut juga menunjukkan bahwa kultur murni Shigella sonnei tidak menghasilkan puncak dan nilai Tm yang menandakan
bahwa primer tidak dapat mendeteksi bakteri lain selain Salmonella khususnya serovar Typhimurium. Shanmugasundaram et al. 2009 dalam penelitiannya dimana menggunakan reverse dan forward
primer InvA dengan urutan nukleotida yang sama menunjukkan hasil yang sama pula dengan penelitian ini dimana primer InvA tersebut spesifik Salmonella. Hasil tersebut ditunjukkan dengan
dapat teramplifikasinyamenghasilkan uji positif pada berbagai subspesies dan serovar Salmonella dengan strain yang berbeda tetapi tidak dapat mengamplifikasimenghasilkan uji negatif pada jenis
mikroba selain Salmonella seperti Escherichia coli, Bacillus cereus, Yersinia intermedia, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila,
dan Staphylococcus aureus.
F. Kuantifikasi Salmonella Typhimurium pada Sampel Pangan Susu UHT
Pada
pengkuantifikasian Salmonella Typhimurium pada sampel susu UHT diperoleh dua jenis kurva standar yaitu kurva standar yang dihasilkan dari isolattemplate DNA dengan metode
pendidihan dan kurva standar yang diperoleh dari isolattemplate DNA dengan metode kit komersial. Kedua kurva standar yang dihasilkan tersebut menghasilkan efisiensi pengujian, nilai R
2
dan slope yang berbeda.
1. Kurva Standar Metode Pendidihan
Kurva standar yang dibuat dengan menggunakan isolattemplate DNA dengan metode pendidihan menghasilkan slope sebesar -1,455 dimana nilai tersebut tidak berada dalam selang
slope yang diharapkan, sehingga nilai efisiensi yang diperoleh tidak bagus yaitu sebesar 386,8
dan nilai R
2
yang rendah yaitu sebesar 0,824. Kurva standar yang dibuat dengan metode pendidihan ini tidak dapat digunakan dalam pengkuantifikasian Salmonella Typhimurium dalam
sampel susu UHT spike karena akan menyebabkan ketidaksesuaian dari hasil yang diperoleh. Kurva standar yang dihasilkan dari isolat DNA dengan menggunakan metode pendidihan
ditunjukkan pada Gambar 15. berikut ini dan nilai threshold cycle Ct serta kurva amplifikasi yang dihasilkan untuk membuat kurva standar ini dapat dilihat pada Lampiran 14a. dan Lampiran
14b. Kurva pelelehan dan kurva puncak pelelehan yang dihasilkan dalam membuat kurva standar dapat dilihat pada Lampiran 15a. dan Lampiran 15b., sedangkan tabel suhu pelelehannya dapat
dilihat pada Lampiran 15c.
34 Gambar 15. Kurva standar metode pendidihan
Nilai efisiensi pengujian dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah urutan sekuen yang diamplifikasi, urutan sekuen primer yang digunakan, panjang sekuen yang diamplifikasi,
dan kemurnian isolat DNAinhibitor yang terdapat pada isolat Siebert 1999. Kurva standar yang dihasilkan dengan metode pendidihan ini memiliki efisiensi yang buruk, hal tersebut dikarenakan
tidak murninya isolat DNA yang digunakandihasilkan dari metode pendidihan. Ketidakmurnian isolat DNA dapat dilihat dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer
pada Lampiran 16. dimana nilai rasio tidak berada pada selang 1,8-2,0 dan nilai konsentrasi protein yang begitu tinggi. Keberadaan inhibitor pada suatu reaksi real-time PCR dapat
ditunjukkan dengan meningkatnya nilai efisiensi yang dikarenakan meningkatnya nilai Ct dan penurunan nilai absolut dari slope Pestana et al. 2010.
Selain itu tingginya nilai persentase effisiensi yang diperoleh 110 menjadi indikator terjadinya pippeting error ketika dilakukannya pengenceran, terjadinya amplifikasi pada produk
yang non-spesifik, dan keberadaan dari primer-dimer Pestana et al. 2010. Primer-dimer merupakan proses saling berikatannya primer baik itu sesama reverse primer, sesama forward
primer, maupun antara reverse dan forward primer yang teramplifikasi dan terkuantifikasi sehingga dihasilkan pengujian yang false-positive sampel yang negatif menghasilkan uji yang
positif Pestana et al. 2010. Berdasarkan hasil tersebut perlu dilakukan pengembangan metode pendidihan lebih lanjut
untuk mengatasi inhibitor yang terbawa pada isolat DNA salah satunya adalah dengan menambahkan Chelex-100 pada metode pendidihan seperti yang dilakukan oleh Kim et al. 2001
pada penelitiannya mengenai pengujian S. aureus pada sampel susu mastitis dimana metode pendidihan yang dilakukannya menghasilkan sensitivitas pengujian yang rendah. Chelex-100
merupakan resin pengkelat berupa kopolimer styrene divinilbenzene yang mengandung pasangan ion-ion iminodiasetat. Chelex-100 efisien diregenerasi di dalam asam encer dan dapat digunakan
dalam kondisi basa, netral, dan asam lemah pada pH 4 atau lebih tinggi. Chelex-100 bertindak sebagai penukar anion pada pH yang sangat rendah. Resin chelex-100 memiliki banyak kegunaan
diantaranya adalah menghilangkan logam dari reagen dan media kultur, mempurifikasi dinukleotida, menghilangkan kalsium di dalam darah, dan ekstraksi DNA untuk PCR Bio-Rad
Laboratories 2011. Kim et al. 2001 juga telah mengujikan metode pendidihan dengan menambahkan PBS dan metanol untuk menghilangkan inhibitor pada susu, namun hasilnya isolat
DNA yang dihasilkan tetap mengandung inhibitor dimana mempengaruhi aktivitas Taq DNA Polimerase yang digunakan.
E=386,8 R
2
=0,824 slope=-1,455 y-int=35,444 Log Starting Quantity, fold dilution
Thre shold C
y cle
35 Selain itu juga dapat menambahkanmenggantikan suatu komponen yang mengatasi inhibitor
pada saat pengujian sampel susu dengan real-time PCR. Salah satunya dengan mengganti Taq DNA Polimerase dengan menggunakan Tth DNA Polimerase seperti pada penelitian yang
dilakukan oleh Kim et al. 2001. Menurutnya, Tth DNA Polimerase lebih sensitif daripada Taq DNA Polimerase dalam pengujian sampel susu karena Taq DNA Polimerase diganggudihambat
oleh inhibitor yang terdapat pada susu. Selain itu, Tth DNA Polimerase dapat menghasilkan data yang konsisten pada pengujian sebanyak tiga kali ulangan.
2. Kurva Standar Metode Kit Komersial
