Isolasi Koloni Diskret dari Kultur campuran

14.3.1 Isolasi Koloni Diskret dari Kultur campuran

Teknik yang umum digunakan untuk mengisolasi koloni diskret didasari oleh kebutuhan akan or- ganisme tertentu. Dengan demi- kian mulai dikembangkan apa yang disebut kultur murni. Untuk membuat kultur murni dari kultur campuran harus dilakukan dua langkah utama, yaitu : 1) kultur campuran diencerkan sehingga mikroba secara individual menja- di terpisah cukup jauh pada per- mukaan lempeng agar, sehingga setelah masa inkubasi masing- masing koloni dapat dipisahkan dari lainnya. Lempeng agar se- perti ini disebut lempeng isolasi dan 2) mikroba yang sudah di- pisahkan dari lempeng isolasi selanjutnya dipindahkan ke me- dia steril lainnya. Setelah diinku- basi, semua organisme di media kultur yang baru akan tumbu ber- sama dengan jenisnya. Kultur ini dikenal sebagai kultur murni.

14.3.1.1. Metode streak-plate

Metode streak-plate (lempeng go- res) adalah teknik menumbuhkan mikroba di dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini mikroba yang tumbuh Metode streak-plate (lempeng go- res) adalah teknik menumbuhkan mikroba di dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini mikroba yang tumbuh

sen.

Teknik isolasi mikroba ini dapat dianggap cepat secara kualitatif.

f) Goreskan ke atas permukaan Ini merupakan teknik pengencer-

agar dalam cawan petri se- an penting yang melibatkan pe-

cara perlahan-lahan. Usaha- nyebaran satu ose kultur ke per-

kan jangan sampai agar han- mukaan lempengan agar.

cur atau tergores.

g) Letakkan ose yang telah beri- goreskan mikroba ke media agar,

Ada beberapa cara untuk meng-

si mikroba di atas permukaan diantaranya adalah penggoresan

agar pada daerah 1 hingga four way atau quadrant streak.

mikrobanya menempel pada Adapun cara kerja metode lem-

permukaan agar. peng gores adalah sebagai beri- kut :

h) Ose dibakar hingga berpijar

a) Tuang media agar cair ke da- dan dinginkan. Letakkan ose lam cawan petri, lalu biarkan

pada lempengan agar dimana hingga mengeras.

terdapat mikroba dan gosok- an secara cepat beberapa kali

b) Bagi tiga bidang permukaan ke permukaan daerah 1. atas cawan petri yang akan digores dengan spidol atau

i) Bakar kembali ose hingga lainnya.

berpijar dan dinginkan. Putar cawan petri hingga membuat

c) Bakar jarum ose dari bagian o sudut 90 dengan daerah 1. pangkal dalam terus hingga

Sentuhkan ose ke media kul- ke bagian lup (ujung) sampai

tur di daerah 1, dan gosokan berpijar merah.

beberapa kali ke media agar di daerah 2.

d) Panaskan bibir tabung reaksi yang berisi kultur mikroba de-

j) Bakar kembali ose dan di- ngan cara memutar tabung

nginkan. Putar kembali ca- sehingga semua bagian bibir

wan petri hingga membentuk

tabung terkena api. o sudut 90 dengan daerah 2.

Ambil mikroba dari daerah 2

e) Segera masukkan jarum ose dan goreskan di daerah 3 ke dalam tabung reaksi untuk

dengan cara yang sama mengambil mikroba, lalu se-

seperti di daerah 2 (Gambar gera keluarkan. Usahakan ke-

tika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan selalu di-

Penyebaran mikroba dilakukan dengan menggunakan L-shaped bent rod dimana cawan petri diletakan pada ”lazy-susan” turntable sehingga dapat diputar hingga 360 o (Gambar 14.10).

Gambar 14.9. Isolasi mikroba dengan metode lempeng gores

Sumber :

www.thesciencefair.com/Merch

Gambar 14.10. Inokulasi

ant2/merchant.mvc... mikroba dengan metode lempeng sebar

k) Tanpa membakar kembali Sumber : ose, putar kembali cawan pe-

www.thesciencefair.com/Merchant2/

tri hingga membuat sudut 90 o merchant.mvc... dengan daerah 3. Ambil

mikroba dari daerah 3 dan Adapun tahapan inokulasi goreskan ke daerah 4 mikroba dengan metode lempeng

dengan membentuk garis sebar adalah ebagai berikut : yang lebar.

a) Letakan bent glass rod ke

l) Bungkus cawan petri dengan

dalam gelas beaker dan

kertas coklat, inkubasi dalam

tambahkan etil alkohol 96 %

inkubator dan amati koloni

hingga menggenangi bagian

yang terbentuk.

bawah bent.

b) Dengan ose yang telah disterilkan, ambil satu ose

14.3.1.2 Teknik spread-plate

penuh kultur mikroba dan

Teknik spread-plate (lempeng

letakan ke bagian pusat dari

sebar atau juga sering disebut

agar plate. Pasang kembali

spin plate) membutuhkan

tutupnya.

campuran mikroba yang

dilarutkan terlebih dahulu. c) Keluarkan glass rod dari

Selama inokulasi, sel akan

gelas beaker dan bakar di api

disebar ke seluruh permukaan

pembakar Bunsen. Posisi

medium agar padat dengan steril.

bagian bent dari glass rod bagian bent dari glass rod

tangan selama beberapa kali. terbakar mengalir ke tangan. Biarkan hingga alkohol yang

d) Pipet larutan pengenceran terbakar mati semuanya.

tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.

d) Dinginkan rod selama 10-15 detik. Buka tutup cawan petri

e) Putar cawan petri secara dan putar pada ”lazy-susan”

perlahan-lahan di atas meja turntable. Selama ”lazy-

untuk meratakan larutan dilusi susan” turntable berputar,

tadi di atas permukaan media sentuhkan bent rod steril ke

agar.

permukaan agar. Gerakan di- ulangi kembali sehingga kul-

f) Lakukan proses inkubasi dan tur mikroba menjadi tersebar

amati pertumbuhan koloni di permukaan media agar.

mikroba.

e) Bila gerakan berputar ”lazy- susan turntable” telah ber-

Adapun cara kerja lempeng sebar henti, letakkan kembali tutup

menggunakan metode swab cawan petri. Rendam rod da-

(usap) adalah sebagai berikut : lam alkohol dan bakar kem- bali.

a. Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras.

Selain menggunakan L-shaped bent rod, teknik lempeng sebar

b. Pipet beberapa ml kultur juga dapat dikerjakan dengan

mikroba dan kemudian cam- menggunakan pipet dan metode

purkan ke dalam beberapa ml swab. Adapun cara kerja lem-

aquades sesuai dengan dilusi peng sebar menggunakan pipet

yang dikehendaki. adalah sebagai berikut :

c. Aduk hingga merata dengan

a) Tuang media agar cair ke cara memutar tabung reaksi dalam cawan petri, lalu

dengan telapak tangan selaa biarkan hingga mengeras.

beberapa kali.

b) Pipet beberapa ml kultur mikroba dan campurkan ke

d. Masukkan swab stick (tangkai dalam beberapa ml aquades

apus) steril ke dalam tabung sesuai dengan pengenceran

reaksi hingga bagian kapas- yang dikehendaki.

nya tenggelam di dalam la-

c) Aduk campuran hingga me- rutan dilusi. Usahkan mema- rata dengan cara memutar

sukkan tangkai apus jangan sukkan tangkai apus jangan

c) Pipet larutan tersebut seba- tabung reaksi.

nyak + 1 ml ke dalam cawan petri.

e. Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan seca-

d) Tuang media agar yang ma- ra merata. Ingat, usahakan o sih cair (suhu + 50

C) ke jangan sampai agar hancur

dalam cawan petri tersebut atau tergores.

(Gambar 14.11).

f. Lakukan proses iInkubasi dan

e) Putar cawan petri secara per- amati pertumbuhan koloni

lahan-lahan di atas meja mikroba.

horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan kultur mikroba.

14.3.1.3 Teknik Pour Plate

Teknik pour-plate (lempeng tu-

f) Lakukan proses inkubasi dan ang) adalah teknik inokulasi mi-

amati pertumbuhan koloni kroba di dalam media agar de-

bakteri.

ngan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan kultur mikroba.

Teknik lempeng tuang biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroba yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar.

Adapun tahan kerja teknik lem- peng tuang adalah sebagai beri- kut :

a) Pipet beberapa ml kultur mik- roba dan campurkan dengan beberapa ml aquades sesuai dengan pengenceran yang di- kehendaki.

b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi menggunakan kedua telapak tangan selama beberapa kali.

menggunakan isolat yang berasal tabung secara cepat me-lalui dari campuran kultur agar streak-

api pembakar Bunsen; 4) plate dan/atau spread plate.

Inokulasi agar miring dengan cara menggeser jarum ose

Adapun prinsipnya adalah koloni dari bawah ke arah atas yang telah disebar dengan baik

membentuk gerakan zigzag akan berkembang pada permuka-

sepanjang permukaan agar. an media agar. Masing-masing

Jangan sampai menggali ke mikroba dapat dipindahkan de-

dalam media agar atau me- ngan jarum steril dan ditum-

rusak permukaan media agar. buhkan pada media agar miring

c) Panaskan kembali leher ta- (agar slant). Masing-masing me-

bung reaksi dan tutup kem- dia agar miring mewakili pertum-

bali.

buhan dari satu spesies mikroba

d) Bakar jarum inokulasi dan dan dirancang sebagai kultur

simpan.

murni atau cadangan (stock).

e) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang

Pembuatan media agar miring tumbuh. Lama proses inku- adalah sebagai berikut : a) Tuang

basi juga mempengaruhi per- media agar ke dalam tabung

hitungan mikroba. Perhitung- reaksi secara aseptis dan b)

an mikroba yang diinkubasi- Dinginkan agar pada tabung re-

kan selama 18 jam memberi- aksi dalam keadaan miring (+ 20-

kan hasil lebih baik dibanding-

30 0 ) kan 24 jam. Namun demiki- an, beberapa mikroba mem-

Prosedur pembuatan kultur murni butuhkan masa inkubasi lebih pada media agar miring adalah

lama lagi.

sebagai berikut :

a) Gunakan pinsil lemak untuk menandai tabung reaksi berisi

14.4 Pengujian Mikrobiologi

nutrien agar miring.

14.4.1 Penanganan Sampel

b) Transfer secara aseptik mi- Pengambilan dan penanganan kroba dari media streak-plate

sampel, termasuk pengenceran, dan/atau spread plate dengan

merupakan bagian penting dalam prosedur sebagai berikut : (1)

analisis mikroba pada bahan pa- Bakar jarum ose hingga ka-

ngan. Pengambilan sampel ha- wat berpijar merah dan di-

rus sedemikian rupa sehingga inginkan; (2) Setelah dingin,

dapat mewakili keseluruhan ba- sentuhkan jarum ke koloni mi-

han pangan.

kroba yang diingin-kan pada Sampel yang telah diambil harus agar lempeng gores / sebar;

disimpan dalam wadah tertutup

3) Buka tutup tabung agar untuk mencegah terjadinya kon- miring dan lewatkan le-her taminasi. Pengambilan sampel 3) Buka tutup tabung agar untuk mencegah terjadinya kon- miring dan lewatkan le-her taminasi. Pengambilan sampel

tetap beku/dingin hingga tiba di peralatan yang steril. Sterilisasi

laboratorium Pengiriman sampel peralatan selama di lapangan dilakukan sesegera mungkin. dapat dilakukan dengan pencuci- an dan pembakaran dengan pro-

Pada saat akan dianalisis, sam- pana. Penggunaan alkohol seba-

pel beku harus dicairkan dengan gai anti septik dikhawatirkan akan

cara menyimpannya selama 18 menyebabkan kebakaran.

C dan segera ditangani. Secara umum, semua Wadah yang digunakan untuk sampel harus sudah dianalisis menyimpan sampel harus bersih,

jam pada suhu 2 o -5 o

dalam waktu 36 jam sejak dite- kering, mempunyai tutup besar

rima di laboratorium. dan mampu menyimpan sampel dengan bobot 100 g atau lebih.

14.4.2 Pengujian Morfologis

Kantong plastik sering digunakan Inokulasi mikroba pada agar mi- sebagai wadah sampel. Jangan

ring adalah untuk melihat karak- menulis informasi data sampel teristik koloni bakteri yang tum- langsung ke kantong plastik, teta-

buh. Tiap bakteri memiliki karak- pi gunakan lakban atau kertas

teristik morfologi yang berbeda label.

(Tabel 14.2.).

Data sampel yang dicantumkan

14.4.3 Pewarnaan Mikroba

pada lakban atau kertas label Mikroba berukuran kecil dan ter- antara lain : 1) tempat, hari, lihat transparan atau tidak ber- tanggal dan jam pengambilan warna, sehingga sering menim- sampel; 2) uji mikrobiologis yang

bulkan kesulitan dalam pengama- akan diterapkan; 3) nama dan

tan. Untuk mengatasi hal terse- alamat perusahaan pemohon; 4)

but, mikroba harus diwarna terle- kode atau jumlah sampel; 5) bih dahulu. deskripsi sampel; 6) nama dan tanda tangan kolektor; 7) hari,

Pewarnaan dapat dilakukan de- tanggal, dan jam diterima di labo-

ngan dua cara, yaitu pewarnaan ratorium; atau 8) tanda tangan

asam dan basa. Pewarnaan orang yang menerima sampel di

asam yang terdiri dari garam laboratorium. Semua informasi

natrium, kalium, kalsium, atau ini mempengaruhi interpretasi ammonium yang bersifat negatif. dan hasil akhir.

Pewarnaan basa yang terdiri dari garam klorida dan sulfat yang

Sampel yang dikirim ke labora-

bersifat positif.

torium untuk dianalisa harus di- pertahankan seperti dalam kondi- si tempat asalnya. Sampel beku

Tabel 14.2. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Bakteri

Karakter Deskripsi

Ukuran Diameter koloni yang diukur di dalam mm cm Bentuk Keseluruhan

Sirkular, irregular, punctiform, rhizoid Koloni

Tepi / Margin Entire, lobate, erose, undulate

Elevasi Datar (flat), raised, convex (cembung), pulvinate, umbonate, crateriform

Permukaan Wrinkled, rough (kasar), concentric rings, dull, glistening, seperti berlemak

Pigmentasi merah, kuning, krim, putih, tidak berwarna

Kelarutan dalam air larut dalam air, tidak larut dalam air

Opasitas Transparan, translucent, opaque

Bau manis, busuk, menyerupai bau buah

Teknik pewarnaan mikroba dapat kah koma, batang, spiral atau dilakukan dengan dua cara, yaitu

bulat) dan bentuknya (apakah pewarnaan sederhana dan dife-

berbentuk rantai, berpasangan, rensial. Pewarnaan sederhana

berempat ( tetrad) atau banyak adalah pewarnaan yang hanya

( kluster)).

menggunakan satu pewarna saja. Pewarnaan sederhana (Gambar

Pewarnaan diferensial adalah pe-

14.12) dilakukan untuk melihat warnaan yang menggunakan dua bentuk morfologis mikroba (apa-

zat pewarna. Pewarnaan diferen- zat pewarna. Pewarnaan diferen-

mikroba yang membentuk partikel komponen yang akan diamati melayang ( flocculent) di dalam dengan sekelilingnya, sehingga media broth. Ada yang terse- akan memberi kemudahan dalam

dimentasi, melayang di per- pengamatan mikroba (Gambar mukaan saja ( pellicle) dan ada 14.13).

pula yang melayang di permuka- an berbentuk seperti cincing ( ring).

Gambar 14.12. Pewarnaan sederhana ditujukan untuk mengamati bentuk

morfologis mikroba

Sumber : Dennis Kunkel Microscopy, Gambar 14.13. Pengamatan inti Inc.

sel dengan pewarnaan diferensial

Sumber : Dennis Kunkel Microscopy, Pewarnaan diferensial dapat Inc. dibagi dua, yaitu : (1) untuk

memi-sahkan kelompok mikroba sehingga dikenal pewarnaan Gram dan pewarnaan asam; dan

Pengujian turbiditas dapat dilaku-

2) untuk melihat struktur mikroba kan dengan cara berikut : sehingga dikenal pewarnaan fla-

a) Tuang media kaldu ke dalam gel, kapsul, spora, atau inti sel.

tabung reaksi secara aseptis

b) Ambil mikroba dengan cara menggoresnya dari kultur bi-

akan mikroba. Pengujian turbiditas serupa de-

14.4.4 Pengujian Turbiditas

c) Transfer dengan cara meng- ngan teknik agar miring, namun

goreskan ke dalam tabung re- teknik ini menggunakan media

aksi yang berisi kaldu tadi broth (kaldu) dan yang diamati

d) Lakukan inkubasi di dalam in- adalah karakteristik kekeruhan-

kubator dan amati bentuk ko- nya. Tiap mikroba memiliki karak-

loni yang tumbuh teristik turbiditas (kekeruh-an)

14.4.3 Teknik Pengenceran

tumbuhkan ke dalam suatu

Teknik dilusi sangat penting di

media, maka koloni yang tum-

dalam analisa mikrobiologi. Kare-

buh dapat dihitung sehingga

na hampir semua metode perhi-

jumlah sel mikroba dapat di-

tungan jumlah sel mikroba mem-

ketahui dengan persamaan :

pergunakan teknik ini, seperti