Menghitung populasi

14.5. Menghitung populasi

e) Tujuan pengenceran media

mikroba

dari 1/10, 1/100, 1/1000, Populasi mikroba dapat dihitu- 1/10.000 dst adalah apabila

ngan dengan dua cara, yaitu

tiap media pengenceran di-

menghitung secara langsung dan menghitung secara langsung dan

penghitung ( counting cham- pelarut yang digunakan, suhu,

ber). Kotak penghitung terdiri dan lama proses inkubasi. dari kotak-kotak kecil dengan ukuran dan luas tertentu.

Media yang umum digunakan Cairan contoh yang diketahui berupa air steril, air garam steril,

volumenya, diletakan di kotak buffer fosfat steril, dan 0.1 %

penghitung dan ditutup de- pepton steril. Penggunaan air

ngan gelas penutup. Dengan steril dan garam steril dapat

volume contoh yang diketahui merusak beberapa bakteri. Ba-

dan jumlah mikroba pada tiap han pangan dari laut membutuh-

kotak pada kotak penghitung kan pelarut 3 % NaCl, karena

diketahui, maka populasi mi- beberapa mikroba membutuhkan

kroba dapat diketahui garam.

b. Menghitung jumlah sel total secara mikroskopis dengan

Suhu inkubasi berpengaruh ter- menggunakan contoh yang hadap hasil penghitungan popu-

telah diwarnai. lasi mikroba. Suhu inkubasi ber- kisar 25 o – 30 o

C memberikan ha- Kelemahan dari penghitungan sil perhitungan yang lebih tinggi

populasi mikroba secara lang- dibandingkan suhu 37 o

sung antara lain : hendak menumbuhkan Pseudo-

C. Apabila

a. Sel mikroba yang sudah mati monas atau Bacillus, maka pro-

tidak dapat dibedakan dari ses inkubasi sebaiknya menggu-

yang masih hidup nakan suhu rendah.

b. Sel yang berukuran kecil sulit dihitung atau terlewat sehing-

Penghitungan mikroba secara

ga hasil perhitungan membe- langsung dapat dilakukan dengan

rikan hasil dibawah angka se- cara :

benarnya.

c. Kurang peka karena suspensi contoh harus mengandung

minimal 10 14.5.1 menghitung jumlah sel 6 sel per ml.

mikroba yang terlihat di

d. Ketepatan yang tinggi sukar

bawah mikroskop.

diperoleh.

Jumlah sel mikroba yang terlihat

e. Suspensi contoh harus bebas di bawah mikroskop dapat dihi-

dari zat lain karena dapat me- tung dengan cara :

nutupi sel pada saat dihitung.

a. Menghitung secara mikrosko- pis jumlah mikroba dalam co-

14.5.2 Menghitung sel hidup

ntoh dengan volume yang Jumlah mikroba yang hidup dapat

sangat sedikit dan terukur. dihitung menggunakan metode Penghitungan dilakukan de-

penghitungan secara langsung penghitungan secara langsung

bentuk pola angka delapan agar kroba yang hidup terhadap waktu

contoh tersebar merata di seluruh ( Total Plate Count) atau media agar. Inkubasikan di da- Menghitung mikroba secara tidak

lam inkubator. Metode ini paling langsung berdasarkan turbiditas.

peka karena mampu menghitung Prosedurnya lebih cepat namun

mikroba sampai kepadatan 20 harus membuat kurva standarnya

sel/ml. Metode ini kurang praktis terlebih dahulu.

digunakan di lapangan karena membutuhkan peralatan untuk

14.5.2.1 Pertumbuhan dalam mencairkan dan membekukan

agar

media agar.

Berdasarkan anggapan bahwa satu sel mikroba akan tumbuh

Pada cara penyebaran, 0.1 ml dan berkembang menjadi popula-

contoh disebar secara merata di si, maka prinsip dasar dari meng-

permukaan media agar ( spread hitung mikroba adalah satu koloni

plate method) dengan menggu- mikroba mewakili satu sel mikro-

nakan tongkat gelas melengkung

ba. ( bent glass rod). Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam

Sampel dari bahan atau produk inkubator. Metode ini dapat digu- pangan yang sudah dihomogeni-

nakan di lapangan karena media sasi diinokulasi ke dalam atau

agarnya sudah disiapkan terlebih permukaan media agar. Setelah

dahulu. Jumlah mikroba yang diinkubasi, koloni mikroba yang

dapat dihitung dengan metode ini tumbuh dihitung sebagai jumlah

harus mempunyai kepadatan mi- mikroba.

nimal 300 sel/ml.

Proses inokulasi contoh ke media Pada cara penetesan, media agar dapat dilakukan dengan ca-

agar pada cawan petri dibagi ra penuangan, penyebaran, dan

menjadi 3-4 sektor dengan mem- penetesan.

beri garis di dasar cawan petri. Pada cara penuangan, 1 ml Larutan contoh sebanyak 0.02 ml contoh dipindahkan ke dasar diteteskan di masing-masing sek- cawan petri dan 15-20 ml media

tor. Setelah contoh mengering, agar cair dituangkan di atasnya.

lakukan inkubasi di dalam inku- Untuk mencegah kematian mi-

bator. Keuntungan dari metode kroba contoh, suhu media agar

ini adalah proses penghitungan cair yang dituangkan berkisar dapat diulang sesuai jumlah sek-

45 o – 50 o

C. Bila suhunya terlalu

tor yang dibuat.

rendah akan menyulitkan karena sudah mulai mengental. Selan-

Keuntungan dari metode pertum- jutnya cawan petri digeserkan di

buhan agar adalah dapat diketa- buhan agar adalah dapat diketa-

nya membutuhkan waktu 24 diketahui adanya mikroba jenis

jam atau lebih lain yang terdapat dalam contoh.

Adapun kelemahan dari metode

14.5.2.2 Penyaringan dengan

ini adalah :

membran

1. Kemungkinan terjadinya kolo- Pada metode penyaringan de- ni yang berasal lebih dari satu

ngan membran ( membrane filtra- sel mikroba, seperti pada tion), larutan contoh disaring mikroba yang berpasangan, dengan menggunakan membran

rantai atau kelompok sel. steril atau filter dengan pori-pori Kemungkinan ini akan mem-

yang cukup untuk menahan mi-

perkecil jumlah sel mikroba kroba. Membran dengan ukuran yang sebenarnya.

lubang 0.45 μ dapat digunakan

2. Kemungkinan adanya jenis untuk menghitung bakteri dan mikroba yang tidak dapat kamir. tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH,

Membran selanjutnya dipindah- atau kandungan oksigen se-

kan secara aseptis ke cawan lama masa inkubasi.

steril berisi kertas saring yang

3. Kemungkinan ada jenis mi- dijenuhkan dengan media nutrien kroba tertentu yang tumbuh

cair. Membran juga dapat dipin- menyebar di seluruh permu-

dahkan ke media nutrisi dalam kaan media agar sehingga cawan petri. Bagian membran menghalangi mikroba lain. yang ada mikrobanya mengha- Hal ini akan mengakibatkan

dap ke atas. Selanjutnya lakukan

mikroba lain tersebut tidak inkubasi agar koloni yang tumbuh terhitung.

di permukaan kertas saring dapat

4. Penghitungan dilakukan pada

dihitung.

media agar yang jumlah po- pulasi mikrobanya antara 30 –

Beberapa keuntungan dari meto- 300 koloni. Bila jumlah popu-

de penyaringan dengan membran lasi kurang dari 30 koloni adalah : akan menghasilkan penghitu-

a. Metode ini sangat peka kare- ngan yang kurang teliti secara

na dapat menghitung sel mi- statistik, namun bila lebih dari

kroba hingga kepadatan 5 300 koloni akan menghasil-

sel/100 ml.

kan hal yang sama karena

b. Proses penyaringan berlang- terjadi persaingan diantara

sung cukup cepat koloni.

5. Penghitungan populasi mikro- Sedangkan kelemahan dari meto-

ba dapat dilakukan setelah

de ini adalah tersumbatnya mem- de ini adalah tersumbatnya mem-

Bila 1 ml larutan A, B, C, dan D seperti air dan minuman, dari-

dipindahkan ke tabung berisi pada homogenat bahan pangan.

kaldu nutrien ( nutrient broth) akan selalu ditemukan pertumbuhan.

Namun pada larutan E akan dite- Teknik Most Probable Number mukan hanya sekali dalam dalam (MPN) banyak digunakan untuk

14.5.2.3 Teknik MPN

sepuluh kali pemindahan larutan menghitung populasi mikroba da-

ke kaldu nutrien. lam bahan atau produk pangan. Penghitungan mikroba dengan Dari masing-masing larutan di teknik MPN merupakan kombi-

atas, pindahkan ke tiga atau lima nasi antara pertumbuhan popula-

tabung berisi kaldu nutrien. Ma- si mikroba dan Tabel Mc Crady.

sing-masing tabung mendapat 1 ml. Masing-masing tabung diin-

Teknik MPN didasarkan pada kubasi dan diamati apakah ada pengenceran contoh. Prinsipnya,

pertumbuhan.

bila contoh diencerkan terus me- nerus maka akhirnya akan diper-

Tabung dengan kelarutan terting- oleh larutan yang tidak mengan-

gi, dimana tiga tabung memperli- dung mikroba (steril). Teknik ini

hatkan pertumbuhan positif dica- akan memberikan hasil baik bila

tat bersama dengan hasil yang asumsinya terpenuhi, yaitu : 1)

diperoleh pada dua pengenceran sel mikroba tersebar merata berikutnya. Misalnya ketiga ta- dalam contoh dimana gaya tarik

bung yang memperlihatkan per- atau tolak diantara mikroba tidak

tumbuhan positif didapat pada terjadi; 2) larutan yang diinokulasi

pengenceran 10 -3 , maka penga- ke kaldu nutrien akan memper-

matan pertumbuhan dilakukan lihatkan pertumbuhan positif apa-

pada tabung dengan pengencer- bila mengandung satu atau lebih

an 10 -4 dan 10 -5 . Bila pada mikroba hidup; dan 3) terhindar

pengenceran 10 -4 menunjukkan dari pencemaran yang berasal

dua dari tiga tabung positif tum- dari bahan dan peralatan.

buh dan pada pengenceran 10 -5 tidak dijumpai tabung yang positif

Dalam prakteknya, apabila con- tumbuh, maka diperoleh hasil 3/3, toh A mengandung 1000 sel/ml

2/3, dan 0/3. Hasil pembacaan diencerkan 10 kali, maka akan

dengan menggunakan tabel Mc dihasilkan larutan B dengan kan-

Crady dapat diketahui konsen- dungan 100 sel/ml. Bila diencer-

trasi mikroba dalam contoh. kan lebih lanjut, maka akan diha- silkan larutan C, D, dan E dengan

Beberapa keuntungan dari meto- kandungan 10 sel/ml, 1 sel/ml,

de MPN ini adalah 1) dapat dibu- de MPN ini adalah 1) dapat dibu-

a. Tidak ada media yang seratus ml/tabung; 2) dapat digunakan

persen selektif, selalu ada dilapangan karena media dapat

mikroba lain yang tumbuh. disipkan sebelumnya; dan 3)

Penambahan komponen ter- untuk tujuan tertentu dapat meng-

tentu akan memberikan per- gunakan media pertumbuhan se-

bedaan berupa warna atau lektif sehingga hanya mikroba

bentuk morfologi. Agar bis- yang diharapkan dapat tumbuh

muth sulfit adalah media baik.

selektif bagi Salmonella, di- mana koloninya terlihat hitam

Kelemahan utama dari metode dan dilingkari warna kaca MPN adalah ulangannya banyak

mengkilat dari endapan bis- sehingga membutuhkan waktu

muth.

dan biaya lebih besar untuk

b. Beberapa mikroba terdapat persiapannya. Dengan kondisi

dalam jumlah sangat sedikit demikian, teknik MPN banyak

sehingga tidak dapat dihitung digunakan untuk menghitung

keberadaannya dengan me- bakteri patogen.

nggunakan teknik pertumbuh- an sebelumnya. Untuk me-

ngetahui keberadaan mikroba Dalam kondisi tertentu diperlukan

14.5.2.4 Penghitungan selektif

tersebut perlu dilakukan pe- penghitungan mikroba secara

mupukan selektif ( selective selektif ( selective counting tech-

enrichment) dengan cara niques), misalnya untuk mengeta-

menginokulasikan contoh ke hui populasi bakteri pembusuk

dalam media cair tertentu atau patogen tertentu. Pada

yang komposisinya telah di- prinsipnya pekerjaan ini dapat

buat sedemikian rupa hingga dilakukan secara mudah dengan

dapat menumbuhkan mikroba menggunakan media selektif. yang diharapkan. Setelah

Media selektif adalah media agar masa inkubasi selesai, contoh yang mengandung zat terpilih se-

yang telah dipupuk ditumbuh- hingga dapat menghambat per-

kan ke dalam media agar tumbuhan mikroba yang tidak

diferensial selektif yang dapat diinginkan namun memberi

membedakan pertumbuhan kesempatan bagi mikroba yang

mikroba diinginkan dengan dimaksud untuk berkembang. mikroba lainnya. Contoh me-

Prosedur yang dilakukan sama dia pemupukan selektif untuk seperti inokulasi dengan meng-

Salmonella adalah tetrathio- gunakan kultur murni.

net broth. Media ini mengan- dung ion tetrathionat yang

Beberapa hal yang perlu akan menekan pertumbuhan diperhatikan dalam penghitungan

mikroba lain.

c. Kerusakan sublethal indol positif dan mampu memfer-

ƒ Sebagian mikroba yang mentasi berbagai karbohidrat se-

terdapat dalam produk perti glukosa, laktosa, manitol pangan sudah mengalami

dan arabinosa.

kerusakan fisiologis dan biokimia akibat proses Ada tiga media yang dapat di- pengolahan, sehingga ti-

gunakan untuk membedakan E. dak dapat hidup secara Coli dan mikroba lain, yaitu : normal. Mikroba ini tidak

Media Eosin Methylene Blue bisa tumbuh pada media

mempunyai keistimewaan me- selektif namun masih da-

ngandung laktosa dan berfungsi pat tumbuh pada media

untuk memilah mikroba yang tidak selektif. Salmonella

memfermentasi laktosa seperti E. yang mengalami kerusak-

coli dengan mikroba yang tidak an subletal akibat pengo-

memfermentasikan laktosa se- lahan dapat tumbuh pada

perti S. aureus; P. aeruginosa media nutrien agar tetapi

dan Salmonella. Mikroba yang tidak dapat tumbuh pada

memfermentasi laktosa mengha- media selektif, karena pe-

silkan koloni dengan inti berwar- ka terhadap senyawa pi-

na gelap dengan kilap logam, lihan yang digunakan da-

sedangkan mikroba lain yang lam media selektif.

dapat tumbuh koloninya tidak ƒ Untuk menghitung popula-

berwarna. Adanya eosin dan si Salmonella sublethal, methylene blue membantu mem- tumbuhkan dahulu dalam

pertajam perbedaan tersebut. kaldu nutrien agar kerusa-

Namun demikian jika media ini kan sublethal yang bersi-

digunakan pada tahap awal, fat sementara dapat di-

karena mikroba lain juga tumbuh sembuhkan dan Salmo-

terutama P. aeruginosa dan nella tumbuh menjadi sel

Salmonella sp dapat menim- normal. Jangka waktu bulkan keraguan. Bagaimanapun yang diperlukan cukup 1 –

media Eosin Methylene Blue

2 jam dan selanjutnya ino- sangat baik untuk mengkonfir- kulasikan ke media selek-

masi bahwa kontaminan tersebut tif.

adalah

E. coli.

Media MacConkey Agar mempu-

14.6. Pengujian mikrobiologi nyai keistimewaan memilah bak-

dasar

teri enterik gram negatif yang memfermentasi laktosa, karena

14.6.1 Pengujian

E. Coli

media ini mengandung laktosa,

E. coli merupakan bakteri gram crystal violet dan neutral red bile negatif, berbentuk batang, uji salt. Kemampuan E. coli mem- E. coli merupakan bakteri gram crystal violet dan neutral red bile negatif, berbentuk batang, uji salt. Kemampuan E. coli mem-

aerogenes antara lain dengan permudah absorpsi neutral red

E. coli untuk mengubah koloni menjadi

reaksi indol. Dimana

mempunyai reaksi positif, sedang merah bata dan mengendapkan

E. aerogenes bereaksi negatif. bile empedu. Koloni lain (S.

Dengan sifat tersebut media ini aureus; P. aeruginosa dan sangat baik untuk memilah

E. coli Salmonella), bila tumbuh tidak dari mikroba lain pada tahap awal akan berwarna karena tidak terutama

P. aeruginosa; S. mampu memfermentasi laktosa.

aureus dan Salmonella. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Entero-

14.6.2 Pengujian Salmonella

bacter; Proteus; Salmonella;

Sp.

Shigella, Aerobacter; Entero- Bakteri Salmonella mempunyai coccus.

karakteristik gram negatif; Ber- bentuk batang, tidak membentuk

Media MacConkey Broth ber- spora, aerob/ fakultatif anaerob. manfaat sekali dalam memilah E. Ia dapat memfermentasi glukosa

coli dari mikroba lain terutama S. dengan membentuk asam/gas aureus, P. aeruginosa dan dan dapat mereduksi nitrat men-

Salmonella. Adanya Oxgall da- jadi nitrit. Mempunyai sifat kata- lam media berperanan dalam lase positif dan oksidase negatif menghambat bakteri gram positip

serta mudah tumbuh pada ke- lain seperti S. aureus. Kandung-

banyakan media. an laktosa sangat penting untuk memilah

E. coli dari mikroba lain Ada empat jenis media yang da- yang tidak memfermentasi lakto-

pat digunakan untuk memilah sa, terutama P. aeruginosa dan

Salmonella dari mikroba lain, Salmonella. Kondisi asam akan

yaitu :

menyebabkan bromo cresol pur-

a. Media agar Bismuth Sulfite ple (media berwarna ungu)

merupakan media yang sa- berubah menjadi kuning (media

ngat spesifik untuk isolasi berwarna kuning) dan adanya

Salmonella typhii dan spesies pembentukan gas yang dapat

lain. Adanya bismuth sulfite diamati pada tabung durham.

dan brilliant green dapat Sedangkan Salmonella dan P.

menghambat pertumbuhan aeruginosa tidak dapat mengu-

gram positip dan coliform. bah warna media karena tidak

Adanya S dalam media akan memfermentasi laktosa. Mikroba

diubah menjadi H 2 S yang lain yang mampu memfermetasi

berperanan mengendapkan laktosa dan mempunyai ekspresi

besi, sehingga koloni berwar- pada media seperti

na coklat-hitam dengan kilap Enterobacter aerogenes.

E. coli adalah

logam. Mikroba lain yang logam. Mikroba lain yang

dengan inti hitam, sedang Vibrionaceae. Media ini sa-

Pseudomonas dapat tumbuh ngat baik digunakan pada

dengan warna merah dan tahap awal untuk memilahkan

Eschericia berwarna kuning. Salmonella dari mikroba lain.

Mikroba lain yang dapat Sedangkan mikroba lain yang

tumbuh pada media ini antara tumbuh terutama Pseudo-

lain Arizona, Proteus, Aero- monas dapat dipilah dengan

bacter, Klebsiella, Citrobacter. media lain.

Begitu banyak mikroba yang dapat tumbuh, sehingga me-

b. Media agar Brilian green me- dia ini kurang dapat memilah ngandung brilian green yang

Salmonella pada tahap awal. sangat baik untuk mengham-

Lebih baik digunakan untuk bat

E. coli dan bakteri yang tahap konfirmasi kontaminan memfermentasi sukrosa dan

Salmonella.

laktosa. Garam empedu ber-

d. Triple Sugar Iron Agar peranan menghambat bakteri

medium, biasanya digunakan untuk batang gram negatif. untuk konfirmasi pengujian E.

Media ini sangat selektif untuk coli dan dapat digunakan isolasi

Salmonella sp. untuk identifikasi bakteri gram Salmonella typhii akan ber-

negatif yang memfermentasi warna merah dikelilingi zona

dekstrosa/ laktosa/sukrosa merah. Pseudomonas diham-

dan produksi H 2 S. Dari fungsi bat, tetapi jika tumbuh menye-

tersebut media ini dapat di- rupai koloni Salmonella ber-

usulkan untuk konfirmasi warna merah. Untuk mene-

Salmonella dan memilahkan tapkan kontaminan tersebut

Pseudomonas yang Salmonella atau Pseudomo-

dari

tumbuh pada media BSA dan nas diperlukan konfirmasi de-

BGA. Terjadinya fermentasi ngan media lain.

dekstrosa oleh Salmonella

c. Media agar Xylose-Lysine- akan menurunkan pH menjadi Desoxycholate digunakan un-

asam. Kondisi ini akan me- tuk isolasi Salmonella dan

nyebabkan perubahan phenol memilah organisme lain de-

red (media merah) menjadi ngan cara memfermentasi

kuning. Sedangkan Pseudo- xylose, dekarboksilasi lysine

monas karena tidak mampu dan produksi H 2 S. Fermentasi

memfermentasi dekstrosa, xylose sangat lazim bagi

maka media akan tetap kebanyakan organisme ente-

berwarna merah. Dengan rik kecuali, Shigella, Providen-

demikian media ini dapat de- cia, Edwardsiella. Pada

ngan mudah memilah Salmo- media ini, Salmonella akan

nella dari Pseudomonas.

koloni akan berubah menjadi

14.6.3 Pengujian

kuning akibat fermentasi man-

Staphylococcus

nitol. Adanya lithium chloride

bermanfaat untuk mengham- Ada tiga jenis media yang dapat

aureus

bat pertumbuhan bakteri lain digunakan untuk membedakan S.

E. coli. Namun Aureus dari mikroba lainnya,

termasuk

demikian media ini kurang yaitu :

mampu memilah S. aurrus

a. Media agar garam mannitol karena semua koagulase po- mempunyai kandungan ga-

sitip dapat tumbuh termasuk ram cukup tinggi, sehingga

S. epidermidis dan Proteus. mikroba lain terutama P.

c. Media Agar Baird Parker

aeruginosa; E. coli; Media ini juga mengandung Salmonella akan dihambat

lithium untuk menghambat pertumbuhannya. S. aureus

pertumbuhan mikroba lain cukup tahan terhadap garam

dan mikroba yang bersifat tinggi, sehingga dapat tumbuh

koagulasi positip akan tum- dengan warna kuning ke-

buh. S. aureus mempunyai emasan dan mediapun beru-

koloni spesifik berwarna hitam bah menjadi kuning. Dengan

akibat endapan hasil telurite demikian media ini sudah

dan media disekitarnya men- sangat selektif dan mampu

jadi jernih. Jenis mikroba memilah S. aureus dari

yang dapat tumbuh antara mikroba lain terutama ketiga

lain Bacillus, Proteus dan mikroba tersebut. Namun

yeast.

demikian ada juga mikroba lain yang dapat tumbuh pada

14.6.4 Pengujian

media tersebut seperti jenis

Pseudomonas

Staphylococcus lain dan

aeruginosa

beberapa mikroba halophili P. aeruginosa mempunyai karak- marine.

teristik berbentuk batang, gram

b. Media agar Vogel Johnson negatif, tidak mampu memfer-

mengandung mannitol, telluri- mentasi tetapi dapat mengok- te dan lithium chloride yang

sidasi glukosa/ karbohidrat lain,

berperan untuk mengisolasi aerob, katalase positip, oksidase bakteri yang bersifat koagula-

positip dan tidak berspora. Ia

se positip, karena semua dapat tumbuh di air suling dan yang bersifat koagulase posi-

akan tumbuh dengan baik tip akan tumbuh pada media

dengan adanya unsur Nitrogen ini. S. aureus mempunyai dan Carbon. koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil reduksi Pengujian bakteri P. aeruginosa tellurite. Media di sekitar dapat dilakukan dengan menggu- dengan adanya unsur Nitrogen ini. S. aureus mempunyai dan Carbon. koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil reduksi Pengujian bakteri P. aeruginosa tellurite. Media di sekitar dapat dilakukan dengan menggu-

da media ini, untuk membedakan P. aeruginosa dari mikroba lain

dapat dibantu dengan menggu- nakan media Pseudomonas Selective Medium yang mengan- dung Nalidixi acid untuk meng-

hambat pertumbunan bakteri lain.