Cara kerja

Cara kerja

a. Pembuatan Kurva Standar Analisa yang dilakukan untuk me-

16.1.1.2 Gula non pereduksi

1. Pipet ke dalam tabung re- nentukan kadar gula non pere-

aksi 0.0 (blanko), 0.2, 0.4, duksi sama seperti analisa yang

0.6, 0.8, dan 1 ml larutan dilakukan untuk menentukan ka-

glukosa standar. Tambah- dar gula perduksi.

kan air sampai total volume masing-masing tabung re-

16.1.1.3 Total gula

aksi 10 ml.

Penetapan total gula dalam bahan

2. Tambahkan dengan cepat 5 pangan dapat dilakukan dengan

ml pereaksi anthrone ke metode :

dalam masing-masing ta-

16.1.1.3.1 Metode Anthrone

bung reaksi

Prinsip dasar dari metode anth-

3. Tutup tabung reaksi (dapat rone adalah senyawa anthrone

menggunakan kele-reng) akan bereaksi secara spesifik

campur merata. dengan karbohidrat dalam asam

4. Tempatkan dalam water sulfat pekat menghasilkan warna

C selama 12 me- biru kehijauan yang khas. Se-

bath 100 o

nit (rendam dalam air men- nyawa anthrone (9,10-dihydro-9-

didih)

oxanthracene) merupakan hasil

5. Dinginkan dengan cepat reduksi anthraquinone.

menggunakan air menga-lir Pereaksi yang digunakan pada

6. Pindahkan kedalam cuvet, metode antrone adalah :

baca absorbansinya pada

1. Pereaksi anthrone 0.1 % dalam

630 nm

asam sulfat pekat. Di-buat

7. Buat kurva hubungan an- hanya pada waktu hari akan

tara absorbans dengan mg digunakan sebab tidak stabil

glukosa

dan hanya tahan satu hari.

2. larutan glukosa standar 0.2

b. Penetapan sampel

mg/ml. Larutan 200 mg glu-

- Masukkan 1 ml sampel (dari encerkan menjadi 100 ml (1 ml = persiapan sampel) ke dalam ta-

0.1 mg glukosa)

bung reaksi

- Selanjutnya lakukan tahap 2 Peralatan yang digunakan :

sampai 6 seperti pada pem-

1. Spektrofotometer buatan kurva standar

2. rak tabung reaksi - Tentukan konsentrasi total gula

3. Penangas air

dalam sampel.

Cara Kerja

a. Ekstraksi

16.1.1.3.2 Metode Cleg-

1. Timbang 1 g sampel ke-

ring atau 2.5 g sampel Tambahkan asam perklorat ke

Anthrone

basah yang mengandung dalam sampel untuk menghidro-

60 – 300 mg total available lisa pati dan gula-gula yang larut

carbohydrate. sehingga dapat bereaksi dengan

2. Pindahkan secara kuanti- anthrone membentuk warna biru

tatif ke dalam gelas ukur kehijauan dan dapat ditentukan

100 ml bertutup. jumlahnya secara kolorimetrik (di-

3. Tambahkan 10 ml air dan nyatakan sebagai persen glu-

aduk dengan mengguna- kosa)

kan gelas pengaduk untuk mendispersikan sampel

Pereaksi yang digunakan : seluruhnya

4. Tambahkan 13 ml asam Tambahkan 270 ml asam per-

15.1.1 Asam Perklorat 52 %

perklorat 52% klorat (BJ 1.70) ke dalam 100 ml

5. Aduk dengan gelas pe- air. Dinginkan sebelum diguna-

ngaduk selama 20 menit kan.

6. Cuci gelas pengaduk di

15.1.2 Larutan Asam Sulfat atas larutan (air cucian Tambahkan dengan hati-hati 760

masuk ke dalam larutan), ml asam sulfat pekat (1.84) ke

encerkan larutan menjadi dalam 330 ml air. Dinginkan

100 ml

sebelum digunakan

7. Campur merata, saring dan

15.1.3 Pereaksi Anthrone 0.1 % masukkan ke dalam labu dalam larutan asam sulfat

ukur 250 ml Buat untuk setiap hari akan

8. Cuci gelas ukur dengan air, digunakan karena pereaksi ini

masukan air cucian ke labu tidak stabil (daya simpan hanya 1

ukur

hari)

9. tepatkan sampai tanda tera

15.1.4 larutan glukosa standar 0.1 dengan air, kocok merata. mg/ml Larutan 100 mg glukosa dalam

b. Penetapan Sampel

100 ml air. Ambil 10 ml larutan,

1. Encerkan 10 ml ekstrak

1. Warna hijau stabil selama 2 sampel menjadi 100 ml

jam

dengan air

2. Hubungan antara absorbans

2. Pipet 1 ml sampel yang dengan kadar glukosa de-ngan telah diencerkan, masuk-

kisaran 0 – 1.15 mg bersifat an ke dalam tabung reaksi

linier dan berbentuk garis lurus

3. Buat blanko dengan me-

masukkan 1 ml air ke 16.1.1.3.3 Metode Fenol

dalam tabung reaksi Metode fenol dapat digunakan

4. Pipet 1 ml larutan glukosa untuk menentukan kandungan standar masukkan ke da-

karbohidrat dan total gula. Prin- lam tabung reaksi

sipnya gula sederhana, oligo-

5. Masukan dengan cepat 5 sakarida, polisakarida dan tu- ml pereaksi anthrone ke runannya dapat bereaksi de-ngan dalam masing-masing ta-

fenol dalam asam sulfat pekat bung reaksi

menghasilkan warna ora-nge

6. Tutup tabung reaksi, cam- kekuningan yang stabil. pur merata

7. panaskan dalam pena-

Pereaksi yang digunakan :

1. Larutan fenol 5% dalam air menit

ngas air 100 o

C selama 12

2. H 2 SO 4 95.5% BJ 1.84

8. Pindahkan larutan ke da-

3. Larutan glukosa standar lam kuvet berdiameter 1 cm

Peralatan yang digunakan :

9. Baca absorbansinya pada

1. Spektrofotometer 630 nm.

2. Penangas air, suhu diperta- o hankan 25 C

3. Pipet yang dapat memindah- Berat sampel = w g

c. Perhitungan

kan 5 ml asam sulfat pekat Absorbansi glukosa standar = a

dengan cepat (10-20 detik) Absorbansi sampel = b

Cara Kerja :

a. Pembuatan Kurva Standar Total ’available carbohydrat’

1. Pipet 2 ml larutan glukosa dinyatakan dalam % glukosa

standar yang mengan- adalah :

dung 0, 10, 20, 30, 40 dan

60 ml glukosa. Masing- (25 x b)

masing dimasukkan ke = --------------------

dalam tabung reaksi. (a x W)

2. Tambahkan 1 ml larutan fenol 5 %, kocok

3. tambahkan dengan cepat 5 Catatan :

ml larutan asam sulfat pekat dengan cara menu- ml larutan asam sulfat pekat dengan cara menu-

Pereaksi yang digunakan dalam

4. Biarkan selama 10 menit, metode DNS adalah : kocok lalu tempatkan da-

1. Pereaksi DNS

lam penangas air selama Larutkan 10.6 g asam 3,5-

15 menit dinitrosalisilat dan 19.8 g

5. Ukur absorbansinya pada NaOH ke dalam 1416 ml air. 490 nm untuk hektosa dan

Kemudian tambahkan ke da- 480 nm untuk pen-tosa dan

lam larutan tersebut 306 g asam uronat

NaAAK-Tartrat, 7.6 ml fenol

6. Buat kurva standar (cairkan pada suhu 50 oC) dan

8.3 g Na-metabisulfit.

b. Penetapan sampel Campuran merata.

1. Untuk menetapkan total Titrasi 3 ml pereaksi DNS karbohidrat, sampel harus

dengan HCl 0.1 N dan dibuat cairan terlebih da-

indikator fenolftalein. Seha- hulu (saring jika terbentuk

rusnya dibutuhkan 5-6 ml HCl endapan) atau lakukan

0.1 N, jika kurang dari itu tahap ekstraksi seperti

tambahkan 2 g NaOH untuk penetapan total karbohi-

setiap kekurangan 0.1 ml HCl drat metod eCleg-Anthro-

0.1 N.

2. Larutan glukosa standar 0.2 – cairan jernih. Untuk me-

ne untuk sampel selain

0.5 mg/ml.

nentukan total gula dan bahan padat, sampel ha-

Peralatan yang digunakan

rus dipersiapkan dahulu

1. Penangas air

2. Lakukan penetapan sam-

2. Spektrofotometer pel seperti pada pem-

3. Tabung reaksi buatan kurva standar kemudian tentukan total karbohidrat atau total gula

Cara Kerja :

1. Sampel disaring agar diper- gai persen glukosa)

sampel (dinyatakan seba-

oleh cairan jernih

2. Masukan 1 ml sampel ke da- lam tabung reaksi, tambahkan

16.1.1.3.4 Metode DNS

3 ml pereaksi DNS Pada prinsipnya metode DNS

3. Tempatkan dalam air men- menciptakan suasana alkali agar

didih selama 5 menit. Biarkan gula pereduksi dapat mereduksi

dingin sampai suhu ruang asam 3,5-dinitrosolisilat (DNS)

4. Encerkan sampel bila diper- membentuk senyawa yang dapat

lukan sampai dapat terukur diukur absorbansinya pada pan-

pada kisaran 20 – 80% T pada jang gelombang 550nm.

panjang gelombang 55º nm. Tambahkan 100 ml NaOH 1 N Gunakan air sebagai blanko.

sambil diaduk, kemudian

5. Buat kurva standar dengan tambahkan 80 ml kuprisulfat menggunakan larutan glukosa

10% (w/v). Tambahkan 180 g standar dengan kisaran 0.2 – 5

Na 2 SO 4 anhydrous, kemudian mg/ml.

tepatkan larutan hingga 1000

6. Untuk sampel yang sedikit ml. Biarkan selama semalam, mengandung glukosa, tam-

kemudian dekantasi superna- bahkan 0.1 mg glukosa ke

tan jernih atau saring dahulu. dalam masing-masing sampel

2. Pereaksi arsenomolibdat

7. Tiga mililiter pereaksi DNS Larutkan 25 g amonium akan bereaksi dengan kurang

molibdat dalam 450 ml air, lebih 10 mg glukosa. Oleh

tambahkan 21 ml H 2 SO 4 pekat, karena itu sampel harus

campurkan merata. diencerkan dahulu sampai

Tambahkan 3 g Na 2 H 2 SO 4 kira-kira mengandung < 5 mg

7H 2 O yang sudah dilarutkan glukosa.

dalam 25 ml air. Aduk dan inkubasi pada 37 o

C selama 24 Catatan :

– 48 jam. Simpan di dalam

1. Reaksi pembentukan warna botol berwarna coklat dan di terjadi pada suasana basa,

dalam lemari.

3. Larutan glukosa standar bersifat asam harus dinetral-

oleh karena itu sampel yang

Larutan stok glukosa standar 1 kan dahulu

% (w/v) dalam asam benzoat

2. Metode ini tidak spesifik dan jenuh diencerkan se-hingga akan mengukur seluruh se-

diperoleh larutan glu-kosa nyawa pereduksi. Jika glu-

standar dengan kon-sentrasi kosa digunakan sebagai stan-

masing-masing 50, 150 dan dar, maka untuk menentukan

300 µg/ml.

selobiosa, nilai yang diperoleh

15 % lebih rendah dari yang

Peralatan

sebenarnya, sedangkan untuk

1. Spektrofotometer

silosa 15% lebih tinggi.

2. Tabung reaksi 16 x 150 mm + tutup gelas atau kelereng

16.1.1.3.5 Metode Nelson-

3. Rak tabung reaksi

Somogyi

4. Penangas air

Pereaksi yang digunakan pada Cara Kerja metode Nelson-Somogyi adalah :

1. Pipet 2 ml larutan sampel

1. Pereaksi tembaga sulfat jernih yang bebas impuritas, Larutkan 28 g Na 2 HPO 4 masukkan ke dalam tabung

anhydrous dan 4 g sodium reaksi, tambahkan 2 ml pe- potasium dalam 700 ml air.

reaksi tembaga sulfat. Tutup intensitasnya dengan tabung reaksi

menggunakan spektrofotometer.

2. Tempatkan tabung reaksi da- lam penangas air 100 o C Pereaksi yang digunakan dalam selama 10 menit, kemudian metode ferisianida basa adalah : dinginkan selama 5 menit

1. Larutan sianida basa

dalam air mengalir Larutan ini dibuat dengan

3. Tambahkan 1 ml pereaksi melarutkan 0.65 g potassium arsenomolibdat, campur sianida kedalam 1000 ml la- hingga rata

rutan sodium karbonat 0.53%

4. Encerkan isi tabung reaksi

(w/v)

sampai volume antara 10 – 25

2. larutan potassium ferisianida ml, tergantung kepekatan

0.05% (w/v) dalam air

warna larutan

3. Larutan feriamonium sulfat

5. Ukur absorbansinya pada 500 Larutan feriamonium sulfat atau 520 nm (absorbansi

dibuat dengan melarutkan 1.5 maksimum pada 660 nm). g feriamonium sulfat ke dalam Blanko dibuat sama seperti di

1000 ml H 2 SO 4 0.05N

atas kecuali sampel diganti dengan air

6. Buat kurva standar dari larutan

Peralatan Utama :

glukosa standar 50, 150 dan

1. Penangas air

300 µg/ml dengan cara yang

2. Spektrofotometer

sama seperti penetapan sampel.

Cara Kerja :

1. Campurkan 2 ml larutan Catatan :

sampel jernih yang bebas

1. Warna yang terbentuk stabil impuritas dengan 1 ml larutan

2. Pemanasan dan pendinginan sianida dan 1 ml larutan untuk seluruh sampel atau

feriamonium sulfat (sampel standar dilakukan secara

diperkirakan mengandung 1 – bersamaan dan seragam.

9 µg glukosa/2 ml)

2. Panaskan dalam penangas sir

16.1.1.3.6 Metode Ferisianida

100 o

C selama 15 menit

3. Warna biru yang terbentuk Prinsip dasar dari metode fer-

Basa

diukur absorbansinya pada isianida basa adalah bahwa di

panjang gelombang 700 nm atas pH 10.5, gula akan mereduksi

4. Buat kurva standar dari larutan ferisianida menjadi ferosianida

glukosa standar 1-10 µg/2 ml yang akan bereaksi dengan ion

yang diperlukan se-perti tahap feri membentuk se-nyawa biru

1 sampai dengan tahap 3. prussian yang dapat diukur

Blanko dibuat de-ngan cara yang sama seperti tahap 1 Blanko dibuat de-ngan cara yang sama seperti tahap 1

dimana larutan sampel diganti

Asam

dengan air. Metode hidrolisis asam dapat digunakan untuk menentukan

Catatan : kadar pati dalam bahan pangan

1. Warna biru yang terbentuk yang diketahui hanya mengan-

stabil dung pati (dan dekstrin). Metode

2. Proses pemanasan harus di- ini memiliki tingkat ketepatan yang lakukan secara serentak dan

rendah.

sama untuk seluruh sampel dan standar.

Prinsip dari metode hidrolisis asam adalah menghidrolisis pati

dengan menggunakan asam Kandungan sukrosa dalam bahan

16.1.1.4 Sukrosa

sehingga terbentuk gula-gula. pangan dapat ditentukan dengan

Gula yang terbentuk selanjutnya mengukur total gula sesudah ditetapkan jumlahnya, sehingga inversi dan total gula pereduksi.

kadar pati kadap diketahui. Metode pengukuran yang dapat digunakan adalah metode Lane-

Pereaksi yang digunakan pada Eynon dan Sahffer-Somogyi. Ni-

metode hidrolisis asam adalah : lai total sukrosa sama dengan total

1. Eter

gula setelah inversi di-kurangi

2. Alkohol 10 % dan 80 % dengan total gula pereduksi

3. HCl ± 25 % (berat jenis 1.125) dikalikan dengan 0.95.

4. NaOH 45 %

Sukrosa = (total gula-total gula Peralatan utama yang digunakan pereduksi) x 0.95

adalah :

1. Timbangan analitik Penentuan sukrosa di dalam ba-

2. Erlenmeyer

han pangan dengan meng-

3. Gelas piala

gunakan metode ini didasarkan

4. Kertas saring

pada asumsi bahwa gula non

5. Pendingin balik pereduksi yang ada di dalam ba-

6. Penangas air

han pangan tersebut seluruhnya atau sebagian besar terdiri dari

Cara Kerja

sukrosa.

1. Timbang 2 – 5 g sampel (berupa bahan padat yang

telah dihaluskan atau bahan Kandungan pati dalam bahan

16.1.1.5 Pati

cair) dalam gelas piala 250 ml pangan dapat ditentukan dengan

2. Tambahkan 50 ml alkohol 80 menggunakan beberapa metode,

% dan aduk selama 1 jam yaitu :

3. Saring suspensi tersebut dengan kertas saring dan cuci 3. Saring suspensi tersebut dengan kertas saring dan cuci

digunakan untuk menentukan terlarut dan dibuang

kadar pati pada biji-bijian, khu-

4. Untuk bahan yang mengan-

susnya tepung.

dung lemak, pati yang ter- dapat sebagai residu pada Pereaksi yang digunakan dalam kertas saring dicuci 5 kali metode polarimetri adalah : dengan 10 ml eter. Biarkan

1. Larutan kalsium Klorida Asam eter menguap dari residu,

Larutan kalsium klorida asam kemudian cuci kembali de-

dibuat dengan melarutkan 620 ngan 150 ml alkohol 10 %

g CaCl 2 .6H 2 O) dalam 180 ml untuk membebaskan lebih

air, saring sampai jernih. lanjut karbohidrat yang ter-larut

Tambahkan 50 ml larutan

5. Pindahkan rsidu secara sodium asetat trihidrat 36% kuantitatif dari kertas saring ke

(w/v) kedalam filtrat jernih. dalam Erlenmeyer dengan

Sesuaikan pH larutan menjadi cara pencucian menggunakan

2.3 dengan menambahkan 200 ml air dan tambahkan 20

asam asetat. Sesuaikan be-rat ml HCl 25%. Tutup dengan

jenis larutan menjadi 1.3 pada pendingin balik dan pasakan di

20 o C.

atas penangan air sampai

2. Larutan carrez I mendidih selama 2.5 jam

Larutan Carrez I dibuat

6. Biarkan dingin dan netralkan dengan melarutkan 21.9 g Zn- dengan NaOH 45% dan

asetat dihidrat dan 30 ml asam encerkan sampai volume 500

asetat ke dalam 100 ml air ml

3. Larutan Carrez II

7. Saring kembali dengan meng- Larutan Carrez II dibuat gunakan kertas saring

dengan melarutkan 10.6 g

8. Tentukan kadar gula yang potassium ferosianida dalam dinyatakan sebagai glukosa

100 ml air

dari filtrat yang diperoleh.

Penentuan glukosa dilakukan Peralatan utama yang digunakan seperti pada penentuan gula

9. Kadar pati dalam bahan

2. Kertas Whatman no. 541 pangan tersebut dapat

3. Polarimeter

diperoleh dengan mengalikan bobot glukosa dengan faktor

Cara Kerja

0.9 1. Campurkan 2.5 g sampel dengan 10 ml air dalam gelas

16.1.1.5.2 Metode Polarimetri

piala tinggi 400 ml sampai terbentuk pasta lembut

2. Tambahkan 50 ml larutan ( 20 α) D = 203

kalsium klorida, aduk hingga rata

3. Masukkan ke dalam otoklaf, 16.1.1.5.3 Metode Ekstraksi

panaskan pada tekanan

Asam Perklorat

103.42 kN/m2 selama 10 menit Metode ekstraksi asam perklorat

4. Dinginkan campuran dengan cukup baik untuk menentukan

cara merendamnya dalam air kadar pati pada serealia. Prinsip- dingin. Pindahkan campuran

nya menentukan kadar gula ke dalam labu ukur 100 ml.

dengan metode Anthrone sehing- Cuci gelas piala dengan

ga kadar pati dalam sampel dapat larutan kalsium klorida dan diketahui. masukkan bilasan ke dalam labu ukur. Tambahkan laru-

Gula bebas dalam sampel harus tan kalsium klorida ke dalam

dihilangkan dahulu dengan cara

labu ukur sampai volume ekstraksi dengan etanol 80 %, campuran kira-kira 90 ml

residu pati yang diperoleh ditam-

5. Tambahkan 2 ml larutan bahkan asam perklorat sehingga Carrez I dan campur hingga

dihasilkan gula yang akan diten- merata. Tambahkan 2 ml tukan kadarnya. larutan Carrez II dan campur hingga merata. Tambahkan

Pereaksi yang digunakan dalam larutan kalsium klorida hingga

metode ekstraksi asam perklorat volume campuran mencapai adalah : 100 ml.

1. Etanol 80 % (v/v)

6. Saring dengan kertas What-

2. Asam perklorat 52% (v/v) man no. 541 hingga diperoleh

Larutan asam perklorat ini filtrat yang jernih

dibuat dengan menambahkan

7. Buang 15-20 ml filtrat bagian 270 ml asam perklorat 72 % ke atas

dalam 100 ml air secara

8. Ukur filtrat pada polarimeter perlahan-lahan

3. Pereaksi Anthrone Perhitungan :

Pereaksi Anthrone diperoleh Kadar pati (g) dalam 100 g bahan

dengan melarutkan 1 g pangan dapat dihitung dengan

Anthrone ke dalam 1000 ml persamaan :

larutan yang mengandung 760

2 SO 4 pekat (larutan H 2 SO 4 = -----------------

4 n x 10 ml H

76%). Buat setiap hari akan 203 x 5

digunakan.

4. Larutan gula standar n = hasil pembacaan polarimeter

Larutan gula standar dibuat pada 20 o

C dalam tabung 2 dm dengan melarutkan glukosa C dalam tabung 2 dm dengan melarutkan glukosa

air sehingga volume-nya menjadi 100 ml

Peralatan utama yang digunakan

7. Buang 5 ml filtrat bagian atas, dalam metode ekstraksi asam

selebihnya saring perklorat adalah :

8. Encerkan sejumlah filtrat

1. Sentrifus sehingga mengandung 100 µg

2. Spektrofotometer

glukosa/ml

3. Magnetic stirrer

9. Ambil 1 ml filtrat yang telah diencerkan, masukan ke dalam

Cara Kerja

tabung reaksi bertutup

1. Timbang 0.2 g sampel dalam karet/kelereng, tambahkan 1 bentuk tepung, masukan ke

ml air dan 10 ml pereaksi dalam tabung sentrifus 50 ml.

Anthrone, campur hingga me- Tambahkan 2 tetes etanol 80

rata

% (v/v) untuk membasahkan

10. Panaskan tabung reaksi da- sampel. Kemudian tambah-

lam penangas air 100 o C kan 5 ml air. Campur hingga

selama 12 menit, dinginkan rata.

11. Buat kurva standar.

2. Tambahkan 25 ml etanol 80 %

12. Baca asorbansinya pada 607 (v/v) panas, campur hingga

nm.

rata, biarkan selama 5 menit, sentrifus

3. Dekantasi supernatan, kemu-

16.1.1.5.4 Metode Enzimatis

dian ulangi ekstraksi dengan Metode enzimatis diawali dengan

30 ml etanol 80% mengekstrak sampel mengguna-

4. Tambahkan 5 ml air kedalam kan dimetilsulfoksida dan asam

residu, kemudian tambahkan sehingga pati terdegradasi. Pati

6.5 ml asam perklorat 52% yang sudah terdegradasi kemu- sambil diaduk di atas magne-

dian dihidrolisa oleh enzim amil- tik stirrer. Lakukan pengadu-

oglukosidase sehingga terbentuk kan selama 5 menit sesudah

gula. Gula yang terbentuk dapat penambahan asam perklorat.

ditentukan jumlahnya dengan sa- Diamkan sebentar. Aduk lagi

lah satu metode penetapan total selama 15 menit.

gula.

5. Tambahkan 20 ml air, sen- trifus kembali

Pereaksi yang digunakan dalam

6. Dekantasi supernatan, ma- metode enzimatis adalah : sukan ke dalam labu ukur 100

1. Dimetilsulfoksida ml. Ekstraksi kembali residu

2. HCl 8 N

seperti sebelumnya (tahap 4

3. Buffer asetat 0.1 M, pH 4.6 s/d 6). Masukan supernatan

4. Larutan amiloglukosidase 10 ke dalam labu ukur yang berisi

mg/ml mg/ml

akan berbeda tergantung dari

1. Penangas air kadar amilosa dalam bahan.

2. Spektrofotometer Pereaksi yang digunakan dalam

Cara Kerja

penentuan amilosa adalah :

1. Sampel sebanyak 100 mg

1. Amilosa standar diekstrak dalam bentuk te-

2. Etanol 95 %

pung bebas gula dengan cara

3. NaOH 1 N

4. Larutan Iod sulfoksida dan 5 ml HCl 8N

menambahkan 20 ml dimetil-

5. Larutan 0.2 g Iod dan 2 g KI dalam penangas air 60 o C dalam 100 ml air.

selama 30 menit

6. Asam asteta 1N

2. Dinginkan, saring jika keruh

3. Encerkan supernatan jernih sehingga mengandung 0.2 –

Peralatan

0.4 pati/liter

1. Penangas air

4. Campurkan 0.2 ml supernatan

2. spektrofotometer dengan 0.2 ml buffer asetat

3. Tabung reaksi

0.1 M, pH 4.6. Tambahkan

4. Labu ukur 100 ml

5. Pipet 1 ml, 2 ml, dan 9 ml. amiloglukosidase (10 mg/ml)

0.02 ml larutan

5. Inkubasi campuran tersebut Cara Kerja meliputi 2 arah :

pada suhu 20 – 25 o

C selama

1. Pembuatan kurva standar

15 menit

1. Timbang 40 mg amilosa mur-

6. Sesudah inkubasi, tentukan ni, masukan kedalam tabung kadar gula campuran dengan

reaksi. Tambahkan 1 ml eta- menggunakan salah satu

nol dan 9 ml NaOH 1N. metode penetapan gula.

2. Panaskan dalam air mendidih selama 10 menit sampai se-

Catatan : mua bahan membentuk gel.

1. Ekstrasi awal dengan asam Setelah itu dinginkan. dan dimetilsulfoksida akan

3. Pindahkan seluruh campuran mengakibatkan beberapa dari

kedalam labu ukur 100 ml. polisakarida mengalami de-

Tambahkan air hingga men- gradasi selain pati.

capai tanda tera

2. Amiloglucosidase akan mela-

4. Pipet masing-masing 1, 2, 3, 4, kukan hidrolisis pada ikatan

dan 5 ml larutan diatas dan glukosidik α-1,2.

masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml.

5. Tambahkan asam asetat 1N Reaksi antara amilosa dengan

16.1.1.6 Amilosa

berturut-turut 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 senyawa Iod akan menghasilkan berturut-turut 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 senyawa Iod akan menghasilkan

diamkan selama 20 menit.

6. Tambahkan air sehingga ting-

6. Ukur intensitas warna de- gi campuran dalam labu ukur

ngan spektrofotometer pa- mencapai tanda tera. Biarkan

da panjang gelombang 625 selama 20 menit.

nm.

7. Intersitas warna biru yang ter-

7. Hitung kadar amilosa da- bentuk diukur dengan spek-

lam sampel. trofotometer pada panjang gelombang 625 nm.

16.1.1.7 Serat kasar

8. Buat kurva standar antara Serat kasar merupakan residu dari konsentrasi amilosa dengan bahan pangan setelah ditam- absorbans.

bahkan asam dan alkali men-didih. Serat kasar terdiri dari se-lulosa,

2. Penetapan sampel

lignin, dan pentosan.

1. Timbang 100 mg sampel dalam bentuk tepung Pereaksi yang digunakan dalam (sampel sebagian besar penentuan serat kasar adalah : terdiri dari pati, jika ba-

a. Antifoam agent nyak mengandung kom-

b. Asbes

ponen lainnya, ekstrak dulu

c. Larutan H 2 SO 4 (1.25 g H 2 SO 4 patinya baru diana-lisis

pekat / 100 ml = 0.225 N

kadar amilosanya), H 2 SO 4 )

d. NaOH (1.25 g NaOH/100 ml = reaksi. Tambahkan 1 ml

masukan kedalam tabung

0.313 N NaOH) etanol 95% dan 9 ml NaOH

e. Larutan K 2 SO 4 10 % 1N.

f. Alkohol 95 %

2. Panaskan dalam air mendi- dih selama 10 menit Peralatan sampai terbentuk gel.

a. Penggiling

3. Pindahkan seluruh gel ke

b. Timbangan analitik dalam labu ukur 100 ml,

c. Soxhlet

kocok, tambahkan air

d. Erlenmeyer 600 ml hingga permukaan larutan

e. Pendingin balik mencapai tanda tera.

f. Kertas saring

4. Pipet 5 ml larutan tersebut,

g. Spatula

masukan keda-lam labu

h. Oven 119 oC ukur 100 ml. Tambahkan 1

i. Desikator

ml asam asetat 1N dan 2 ml larutan Iod.

Cara Kerja

5. Tambahkan air hingga

1. Haluskan sampel sehingga permukaan larutan men-

dapat melalui saringan ber- diamater 1 ml dan aduk hingga dapat melalui saringan ber- diamater 1 ml dan aduk hingga

mendidih, kemudian dilanjut- dihancurkan sebaik mungkin

kan dengan alkohol 95%

2. Timbang 2 g bahan. Eks-traksi

sekitar 15 ml.

lemak sampel dengan metode

11. Keringkan kertas saring atau soxhlet.

krus dengan isinya pada 110

3. Pindahkan sampel ke dalam o

C sampai beratnya konstan Erlenmeyer 600 ml. Jika ada

(1-2 jam), dinginkan dalam tambahkan 0.5 g asbes yang

desikator dan timbang. Ja- telah dipijarkan dan 3 tetes zat

ngan lupa mengurangi berat anti buih (antifoam agent)

asbes (sekali digunakan).

4. Tambahkan 200 ml larutan Berat residu yang diperoleh =

H 2 SO 4 mendidih. Tutup de- berat serat kasar. ngan pendingin balik.

5. Didihkan selama 3 menit dengan kadang-kadang digo-

16.1.1.8 Dietary fiber

yang-goyangkan. Dietary fiber adalah bagian dari

6. Saring suspensi dengan ker- komponen bahan pangan nabati tas saring. Residu yang ter-

yang tidak dapat dicerna oleh tinggal dalam Erlenmeyer saluran pencernaan manusia, dicuci dengan air mendidih. termasuk polisakarida dan lignin. Cuci residu dalam kertas Berdasarkan fungsinya, dietary saring sampai air cucian tidak

fiber dapat dibagi menjadi tiga, bersifat asam lagi (uji dengan

yaitu :

kertas lakmus).

1. Polisakarida struktural, terda-

7. Pindahkan secara kuantitatif pat dalam dinding sel dan residu dari kertas saring ke

terdiri dari selulosa dan dalam Erlenmeyer kembali

polisakarida non-selulosa (he- dengan spatula. Sisanya cuci

miselulosa dan substansi lagi dengan 200 ml larutan

pekak)

NaOH mendidih sampai se-

2. Non-polisakarida struktur, se- mua residu masuk kedalam

bagian besar terdiri dari lignin. Erlenmeyer.

3. Polisakarida non struktural,

8. Didihkan dengan pendingin termasuk gum dan mucilage balik sambil kadang-kadang

serta polisakarida lainnya (ka- digoyang-goyangkan selama

rageenan dan agar dari alga

30 menit dan rumput laut).

9. Saring kembali dengan meng- gunakan kertas saring yang Untuk menganalisa dietary fiber diketahui beratnya atau krus-

telah dikembangkan berbagai geoch yang telah dipijarkan metode, diantaranya yang mudah dan diketahui beratnya, sam-

dan relatif cepat adalah Metode

bil dicuci dengan K 2 SO 4 10 %.

Van Soest. Dengan metode ini Van Soest. Dengan metode ini

1. Pendingin tegak Detergent Fiber (ADF) dan Neu-

2. Pemanas listrik tral Detergent Fiber (NDF). ADF

3. Filter gelas 2-G-3 terdiri dari selulosa dan lignin dan

4. Oven pengering NDF terdiri selulosa, hemiselu-

5. Tanur 450-500 o C losa dan lignin.

6. Timbangan analitik

7. Desikator

Hampir semua komponen dietary fiber dapat dihitung. Kadar hemi-

Cara Kerja :

1. Timbang sampel bentuk te- hitung selisih kadar NDF dengan

selulosa diperoleh dengan meng-

pung lolos ayakan 30 mesh kadar ADF. Kadar selulosa di-

sebanyak 1 g dan masukan ke peroleh dengan menghitung

dalam Erlenmeyer. selisih kadar ADF dan kadar lignin.

2. Tambahkan 100 ml larutan Total dietary fiber dihitung dengan

ADF; didihkan pada pendingin menjumlahkan kadar NDF dengan

tegak selama 60 menit. kadar subs-tansi pekat.

3. Saring dengan filter gelas 2-G-

3, endapan yang diperoleh

16.1.1.8.1 Penentuan kadar ADF

dicuci dengan akuades panas Sampel yang akan diuji diekstrak

beberapa kali. dengan larutan setiltrimetil amo-

4. Endapan dicuci beberapa kali nium bromida (ADF) dalam H 2 SO 4 dengan aseton

1N sehingga seluruh komponen

5. Keringkan filter gelas dan en- selain komponen ADF larut. dapan dalam oven 100 o C

Komponen yang tidak larut sampai diperoleh berat yang kemudian disaring, dikeringkan,

tetap (sekitar 8 jam), timbang. ditimbang, dan dikoreksi dengan

6. Abukan endapan pada tanur kandungan mineral yang ada

C hingga dalam komponen tersebut de-

bersuhu 450 – 500 o

diperoleh berat yang konstan ngan cara menyabunkannya se-

(sekitar 3 jam) timbang. hingga yang tinggal hanya mine- ralnya saja.

Perhitungan :

(a – b) Pereaksi yang digunakan dalam

% kadar ADF = --------------- x 100 penetapan ADF adalah :

(W)

1. Larutan ADF Larutan ADF dibuat dengan me-

Dimana :

larutkan 20 g setil trimetil amo-

a = berat filter dan endapan nium bromida dalam 1 liter H 2 SO 4 setelah dikeringkan (g) 1N.

b = Berat filter dan endapan

2. Aseton setelah diabukan Peralatan yang digunakan dalam

c = berat awal sampel (g) penetapan ADF adalah :

16.1.1.8.2 Penentuan kadar NDF

6. Filter gelas 2-G-3 Penetapan NDF diawali dengan

7. Oven pengering 100 o C mengekstrak sampel dengan la-

8. Tanur 450-500 o C rutan NDF sehingga seluruh kom- ponen selain NDF larut. Kompo-

Cara kerja :

nen yang tidak larut kemudian

1. Timbang 0.5 g sampel bentuk disaring, dikeringkan, ditimbang

tepung lolos ayakan 30 mesh dan dikoreksi dengan kandungan

dan masukkan ke dalam mineralnya yang ada dalam

Erlenmeyer.

komponen tersebut.

2. Tambahkan 30 ml larutan α- amilase dan inkubasi pada

C selama 16 jam pati, patinya harus dihidrolisis da-

Untuk sampel yang mengandung

suhu 40 o

(semalam).

hulu dengan menggunakan α-

3. Tambahkan 200 ml larutan amilase sehingga tidak menye-

NDF dan 0.5 g Na 2 SO 3 . babkan kesulitan selama penya-

4. Refluks campuran pada pan- ringan.

dingin tegak selama 60 menit

5. Saring campuran melalui filter Pereaksi yang digunakan dalam

2-G-3 dan cuci dengan akua- penentuan NDF adalah :

des panas beberapa kali.

1. Larutan NDF

6. Bilas endapan dengan aseton Larutkan 18.61 g EDTA-2Na,

beberapa kali.

7. Keringkan filter dan endapan Sodium lauril sulfat, 4.56 g

6.81 g Na 2 B 4 O 7 .10H 2 O, 30 g

pada oven yang bersuhu 100 Na 2 HPO 4 dan 10 ml 2-etoksil-

C sampai diperoleh bobot etanol dalam 1 liter. Atur se-

yang konstan (sekitar 8 jam), demikian rupa sehingga pH

timbang.

berkisar 6.9-7.1.

8. Abukan filter dan nedapan pa-

da tanur yang bersuhu 450-

2. Larutan α-amilase o 500

C sampai diperoleh bobot Masukkan 1 g α-amilase ke

yang konstan (sekitar 3 jam), dalam 1 liter buffer fosfat, yaitu

timbang.

0.067 M buffer fosfat (KH 2 PO 4 -

Na 2 HPO 4 ), pH 7.0 ± 0.05.

Perhitungan :

a–b

3. Aseton % kadar NDF = ------------ x 100 W Peralatan yang digunakan :

1. Erlenmeyer

Dimana :

2. Timbangan analitik

a = berat filter dan endapan

3. Desikator setelah dikeringkan (g)

4. Inkubator 40 o C b = Berat filter dan endapan

5. Pendingin tegak setelah diabukan 5. Pendingin tegak setelah diabukan

6. Tambahkan 25 ml H 2 SO 4 72%

dingin (15 o

C) ke dalam filter gelas, aduk dengan gelas

16.1.1.8.3 Penentuan lignin

pengaduk sampai ter-bentuk Kandungan lignin dapat ditentu-

pasta halus. Biarkan gelas kan dengan mengekstrak sampel

pengaduk berada da-lam filter dengan larutan ADF sehingga

gelas.

semua komponen selain selulo-sa

7. Biarkan selama 3 jam pada dan lignin larut. Selulosa yang

C sambil ada dalam residu kemudian dihi-

suhu 20 – 23 o

diaduk-aduk setiap 1 jam

drolisa menggunakan H 2 SO 4 72%

sekali.

sehingga yang tersisa dalam

8. Dengan bantuan vakum laku- residu hanya lignin.

kan penyaringan. Cu-ci resi- du dengan air panas sampai

Pereaksi yang digunakan dalam filtrat bebas asam (cek de- penentuan lignin adalah :

ngan kertas lakmus). Jangan

1. Larutan ADF (lihat penetapan lupa cuci bagian pinggir filter ADF)

dan gelas pengaduk dengan

2. Larutan H 2 SO 4 72% (w/v)

air panas.

3. Aseton

9. Bilas residu dengan ase-ton 2-

3 kali.

Peralatan yang digunakan dalam

10. Keringkan filter gelas dalam penentuan lignin adalah :

oven 100 o

C sampai diperoleh

1. Timbangan analitik berat konstan, masukkan ke

2. Pendingin tegak desikator kemudian timbang.

3. Filter gelas 2-G-4

11. Masukan filter ke dalam tanur

4. Oven o 450 – 500

C sampai diperoleh

5. Tanur berat tetap, biarkan agak dingin, masukkan desi-kator,

Cara kerja :

timbang.

1. Timbang 0.5 g sampel bentuk tepung lolos aya-kan 30 mesh, masukkan ke dalam labu Perhitungan : Erlenmeyer atau labu didih

a–b

2. Tambahkan 100 ml larut-an % kadar lignin = ------------ x 100 ADF

3. Refluks pada pendingin tegak selama 60 menit

Dimana :

4. Saring melalui filter gelas 2-G-

a = berat filter dan endapan

4 setelah dikeringkan (g)

5. Tempatkan filter gelas yang

b = Berat filter dan endapan berisi residu pada gelas piala

setelah diabukan 100 ml.

c = berat awal sampel (g)

1. Timbang sampel dalam ben- tuk tepung lolos ayakan 30

16.1.1.9 Penentuan substansi

mesh sebanyak 0.5 g.

pektat

2. Ekstraksi dengan 25 ml etanol

70 % untuk menghilangkan

16.1.1.9.1 Metode Kolorimetrik

gula-gula.

Prinsip penentuan substansi pek-

3. Saring, endapannya diambil tat dengan metode kolorimetrik

lalu tambahkan 200 ml larutan didasarkan atas reaksi antara O-

versen 0.5 persen. hidroksi difenil dengan anhidro-

4. Inkubasi pada suhu 25 o C galakturonat sehingga mengha-

selama 30 menit untuk silkan warna yang dapat diukur

melarutkan substansi pektat di pada panjang gelombang 520 nm.

dalam sampel.

5. Asamkan campuran sampai Pereaksi yang digunakan dalam

pH 5 – 5.5 dengan meng- penentuan substansi pektat ada-

gunakan asam asetat, kemu- lah :

dian tambahkan 0.1 g pekti- nase, inkubasi pada 25 o C

1. Larutan versene 0.5% selama satu jam. Larutan ini dibuat dengan me-

6. Tambahkan akuades sehing- larutkan 5 g EDTA-4 Na dalam

ga volume campuran menjadi akuades hingga volu-me 1

250 ml, kemudian saring. liter.

7. Dari filtrat yang diperoleh,

2. Larutan tetraborat / sulfat ambil 0.8 ml lalu tambahkan

kedalamnya 4.8 ml larutan dalam H 2 SO 4 pekat

Larutan Na 2 B 4 O 7 0.0125 M

tetraborat / sulfat.

3. Larutan O-hidroksidifenil

8. Dinginkan dengan penangas Larutan O-hidroksidifenil dipe-

es sampai suhu campuran roleh dengan melarutkan 1.5 g

C, kemudian O-hidroksidifenil dalam 1000

mencapai 4 o

kocok dengan vortex mixer. ml NAOH 0.5 persen.

9. Panaskan dengan penangas

C selama 5 menit, dinginkan kembali de- Peralatan yang digunakan :

4. NaOH 0.05 N air bersuhu 100 o

ngan penangas es sampai

1. Vortex mixer

suhu 20 o C.

2. Spektrofotometer

10. Tambahkan 0.08 ml larutan O-

3. Penangas air hidroksidifenil, kocok kem-bali

4. Penangas es (ice bath) dengan vortex mixer.

11. Setelah dibiarkan kurang le-bih

5 menit dan warna telah

Cara kerja :

terbentuk sempurna, ukur

a. Penetapan sampel

absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm.

12. Pembuatan blanko sama se- perti prosedur di atas, kecuali

Dimana :

tidak ditambahkan larutan O-

a = konsentrasi sampel yang hidroksidifenil.

diperoleh

b = volume akhir setelah

b. Pembuatan kurva standar

penambahan pektinase

1. Pembuatan kurva standar

0.8 = volume filtrat yang diambil dilakukan dengan menam-

untuk pengukuran absorbansi bahkan 10 ml NaOH 0.05N

(ml)

kedalam 120.5 mg asam W = bobot sampel galakturonat monohidrit, c = berat awal sampel (g) encerkan sampai volume 500

10 6 = faktor konversi satuan ml dengan akuades. Biarkan selama semalam pada suhu

16.1.1.9.2 Metode Gravimetrik

kamar. Tiap ml larutan stan- Penetapan substansi pektat dila-

dar ini mengandung 20 µg kukan dengan mengekstrak pek- asam anhidrogalakturonat.

tin dari sampel kemudian disa-

2. Masukkan 10, 20, 40, 50, 60, ponifikasi dengan alkali dan dien- dan 80 ml larutan standar dapkan sebagai kalsium pektat masing-masing ke dalam labu

dengan penambahan kalsium ukur 100 ml, tepatkan sampai

khlorida dan suasana asam. En- tanda tera dengan akuades.

dapan kalsium pektat dicuci sam-

3. Setiap 0.8 ml larutan standar pai bebas khlorida, dikeringkan ini diperlakukan sama seperti

dan ditimbang.

pada penetapan sampel, kemudian ukur absorbansinya

Adapun pereaksi yang diperguna- pada 520 nm.

kan untuk penetapan substansi

4. Blanko larutan standar dibuat pektat dengan metode gravimetri sama seperti larutan standar,

adalah :

tetapi tidak ditambahkan O-

1. Asam asetat 1 N hidroksidifenil.

Asam asetat 1N diperoleh dengan mengencerkan 30 ml asam asetat glasial dengan air hingga menjadi 500 ml.

2. Kalsium khlorida 1N

c. Perhitungan

Kalsium khlorida 1N dibuat

dengan melarutkan 27.5 g Anhidrouronat = ----------- x 100%

(a) (b)

CaCl 2 anhidrous dalam air.

6 0.8 (W) 10 Encerkan hingga volumenya mencapai 500 ml.

= kadar substansi

3. Perak nitrat 1 %

pektat didalam sampel

Perak nitrat diperoleh dengan - Tambahankan HCl 0.05 N

pada residu, didihkan se- 100 ml air.

melarutkan 1 g AgNO 3 dalam

lama 20 menit dan saring

4. HCl 0.05 N seperti sebelumnya. - Tambahkan HCl 0.3 N pada residu, didihkan selama 10 Peralatan yang digunakan

menit dan saring.

1. Waring blender - Kumpulkan seluruh filtrat

2. Oven yang diperoleh, dinginkan, dan tepatkan sampai volu-

Cara kerja

me tertentu.

a. Ekstraksi

1. Timbang 50 g sampel yang

b. Jam, Jelly dan Marmalade

sudah diblender dalam wadah

1. Timbang 50 g sampel gelas piala 1000 ml.

dalam wadah gelas piala

2. Ekstrak dengan 400 ml HCl 1000 ml. Sementara itu 0.005 N selama 2 jam pada

siapkan 400 ml air, panas- suhu 80-90 o

kan pada penangas air. yang hilang karena pengua-

C. Gantikan air

2. masukan sampel ke da- pan.

lam air yang sudah disi-

3. Dinginkan, pindahkan seluruh apkan sambil dipanaskan, isinya ke labu ukur 500 ml,

hancurkan sampel de-ngan tepatkan sampai tanda tera

gelas pengaduk. dengan air.

3. Dinginkan. Lalu pindah-

4. Kocok merata, kemudian sa- kan sampel ke dalam labu ring dengan kertas saring

ukur 500 ml. Tetapkan Whatman No. 4, masukkan

sampai tanda tera dengan filtrat ke dalam Erlenmeyer 500

air, kemudian saring de- ml.

ngan kertas Whatman

5. Ulangi ekstraksi terhadap pulp

no.4.

sayuran atau buah-buahan dengan air dingin lalu

c. Penetapan sampel

panaskan ekstrak campuran

1. Pipet 100-200 ml masing- sebelum penyaringan atau

masing alikuot, masukan didihkan pulp dan air tanpa

ke dalam gelas piala 1000 penambahan asam. Untuk

ml. Tambahkan 250 ml air. melarutkan pektin yang tidak

Netralkan dengan pe- larut lakukan ekstraksi asam

nambahan NaOH 1N de- sebagai berikut :

ngan menggunakan fe- - Tambahkan HCl 0.01 N,

nolftalein sebagai indika- didihkan selama 30 mnt.

tor. Tambahkan lagi 10 ml - Saring, cuci endapan de-

NaOH 1 N, sambil ngan air panas.

melakukan pengadukan. 5 (lima) dilakukan pembulat-an Biarkan selama semalam.

naik. Contoh :

2. Tambahkan 50 ml asam asetat 1N, kemudian se-

14.545 Dibulatkan 14.45 telah 5 menit tambahkan

menjadi

25 ml kalsium khlorida 1 N, 14.466 Dibulatkan 14.47 aduk merata.

menjadi

3. Saring dengan kertas sa-

ring yang telah disiapkan

b. Angka desimal 5 (lima) yang sebelumnya (sebelumnya, akan dibulatkan dari angka genap

kertas saring dibasahkan yang ada di depannya, maka dengan air panas, kering-

angka lima tersebut menjadi kan dalam oven 102 o C hilang. Tetapi jika angka dide-

selama 2 jam, dinginkan pannya ganjil maka dilakukan dalam desikator kemudian

pembulatan naik. Contoh : timbang dalam wadah tim-

bang tertutup) 14.765 Dibulatkan 14.76

4. Cuci endapan dengan air menjadi panas yang hampir men-

14.475 Dibulatkan 14.48 didih sampai bebas dari

menjadi khlorida (uji dengan perak

nitrat). Keringkan pada

100 oC selama semalam,

16.2. Analisis protein

dinginkan dengan desika-

16.2.1 Penetapan protein kasar

tor lalu timbang.

16.2.1.1 Metode Kjeldahl

Analisis protein metode Kjeldhal

d. Perhitungan didasarkan pada oksidasi bahan-

bahan berkarbon dan konversi % kalsium pektat = -------------------

a x 500 x 100

nitrogen menjadi amonia. Kemu-

bxc

dian amonia bereaksi dengan ke- lebihan asam membentuk amo-

a = Berat kalsium pektat nium sulfat. Larutan dibuat men-

b = ml filtrat yang digunakan untuk jadi basa dan amonia diuapkan penetapan

untuk kemudian diserap dalam

c = Berat sampel larutan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan dapat

ditentukan jumlahnya de-ngan

titrasi menggunakan HCl 0.02 N. Hasil dicatat pada buku hasil. Bila

16.1.2 Pencatatan hasil

dari hasil perhitungan diper-oleh : Pereaksi yang digunakan dalam

a. Angka desimal kurang dari 5 metode Kjeldhal adalah : (lima) maka dilakukan pembulat-

1. Asam sulfat pekat an turun, sedangkan bila lebih dari

2. Air raksa oksida

3. Kalium sulfat jadi panas), kemudian dingin-

4. Larutan natrium hidroksida-

kan.

natrium tiosulfat (larutkan 60 g

5. Pindahkan isi labu kedalam

alat destilasi. Cuci dan bilas dalam air dan encerkan

NaOH dan 5 g NaS 2 O 3 . 5H 2 O

labu 5-6 kali dengan 1-2 ml air, sampai 100 ml)

pindahkan air cucian ter-sebut

5. Larutan asam borat jenuh ke dalam alat distilasi.

6. Letakkan Erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml larutan H 2 BO 3 Peralatan yang digunakan :

6. Larutan asam khlorida 0.02N.

dan 2-4 tetes indikator

1. Pemanas Kjeldahl lengkap (campuran 2 bagian metil yang dihubungkan dengan pe

merah 0.2% dalam alkohol dan ngisap uap melalui aspirator.

1 bagian metilen blue 0.2%

2. Labu Kjeldahl berukuran 30 ml dalam alkohol) di abwah atau 50 ml.

kondensor. Ujung tabung

3. Alat distilasi lengkap dengan kondensor harus terendam di Erlenmeyer berpenumpang

bawah larutan H 3 BO 3 . 125 ml

7. Tambahkan 8-10 ml larutan

4. Buret 25 ml / 50 ml NaOH-Na 2 S 2 O 3 , kemudian la- kukan destilasi sampai ter- tampung kira-kira 15 ml

Cara Kerja

destilat dalam Erlenmeyer.

8. Bilas tabung kondensor de- pel (kira-kira akan membu-

1. Timbang sejumlah kecil sam-

ngan air, dan tampung bilas- tuhkan 3-10 ml HCl 0.01 N

annya dalam Erlenmeyer yang atau 0.02 N), pindahkan

sama.

kedalam labu Kjeldahl 30 ml

9. Encerkan isi Erlenmeyer

2. Tambahkan 1.9 ± 0.1 g K 2 SO 4 ,

sampai kira-kira 50 ml kemu-

40 ± 10 mg HgO, dan 2 ± 0.1 dian titrasi dengan HCl 0.02N ml H 2 SO 4 . Jika sampel lebih

sampai terjadi perubahan dari 15 mg ± 0.1 g. Bila

warna menjadi abu-abu. La- sampel lebih dari 15 mg,

kukan juga penetapan Blan-ko.

tambahkan 0.1 ml H 2 SO 4 untuk

setiap 10 mg bahan organik di

Perhitungan

atas 15 mg.

3. Tambahkan beberapa butir (a)(b)(c) batu didih. Didihkan sampel

% N = ------------------------------- selama 1 – 1.5 jam sampai

cairan menjadi jernih.

4. Dinginkan, tambahkan sejum-

dimana :

lah kecil air secara perlahan-

a = ml HCl

lahan (hati-hati tabung men-

b = ml blanko

c = normalitas c = normalitas

% protein = %N x faktor konsversi

1. Pereaksi Biuret Pereaksi Biuret dibuat dengan

Faktor konversi kadar protein ber- melarutkan 3 g CuCO 4 .5H 2 O macam bahan pangan

dan 9 g Na-K-Tartrat dalam 500 ml NaOH 0.2 N

Tambahkan 5 g KI, kemudian Bahan

Faktor

Koreksi

encerkan sampai 1000 ml Bir, sirop, biji-bijian, 6.25 dengan menggunakan NaOH

ragi, pakan ternak,

0.2N

buahan teh manisan anggur, tepung jagung

2. Larutan protein standar Buat larutan bovine serum al-

Beras 5.95 bumin dalam air dengan Roti, gandum, 5.70 konsentrasi 5 mg/ml. Ukur makaroni, bakmi

kadar air serum albumin, Kacang tanah

5.46 nyatakan konsentrasi dengan Kedele 5.71 dasar berat kering (agar lebih Kenari

5.18 tepat).

Susu dan produk susu 6.38

Peralatan yang digunakan Penentuan kadar protein dengan

16.2.1.2 Metode Biuret

1. Spektrofotometer metode Biuret merupakan salah

2. Sentrifus

satu cara terbaik. Dalam larutan,

3. Waring Blender basa Cu 2+ membentuk kompleks

dengan ikatan peptida (-CO-NH-)

sehingga menghasilkan warna Cara kerja

ungu dengan absorbans maksi-

1. Pembuatan Kurva Standar

mum pada 540 nm. Absorban

1. Masukkan ke dalam tabung berbanding lurus dengan konsen-

reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2,, 0.4, trasi protein dan tidak tergantung

0.6, 0.8, dan 1 ml protein dari jenis protein karena seluruh

standar. Tambahkan air sam- protein memiliki jumlah ikatan

pai volume total masing- peptida yang sama per satuan

masing 4 ml.

berat.

2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing- Hanya sedikit senyawa lain yang

masing tabung reaksi, campur mengganggu reaksi misalnya urea

hingga rata.

(mengandung gugus –CO-NH-)

3. Simpan tabung reaksi pada

dan gula pereduksi yang akan

C selama 10 menit bereaksi dengan ion Cu 2+ .

suhu 37

atau pada suhu kamar sela-ma

30 menit sampai pemben- protein yang terdenaturasi tukan warna ungu sempurna.

mengendap. Supernatan

4. Ukur absorbansinya pada 520 dibuang dengan cara de- nm.

kantasi.

2. Persiapan sampel

- Kedalam endapan tambah-

1. Sampel harus berupa cairan. kan 2 ml etil eter, campur Jika berbentuk padatan maka

merata lalu sentrifus kem- harus dihancurkan dahulu de-

bali untuk menghilangkan ngan menggunakan waring

residu TCA. Biarkan me- blender dan penambahan air.

ngering pada suhu kamar. Hancuran yang diperoleh di-

- Kedalam endapan kering saring lalu disentrifus. Super-

ditambahkan 4 ml air. natan di dekantasi untuk di-

Campur hingga merata pergunakan selanjutnya (a). (jangan harapkan seluruh-

Protein yang terukur pada nya akan larut). supernatan adalah soluble

- Tambahkan 6 ml pereaksi protein. Perhatikan faktor pe-

Biuret, alkali dalam pere- ngenceran.

aksi ini akan melarutkan

2. Jika cairan berupa larutan nedapan yang tersisa. protein seperti protein kon- sentrat, isolat yang tidak keruh, maka persiapan sam-pel cukup dengan pengen-ceran

3. Penetapan sampel

secukupnya saja. Jika

0.1 – 1 ml sampel (dipipet tepat) cirannya keruh atau me-

dimasukkan kedalam tabung re- ngandung bahan-bahan yang

aksi, kemudian diperlakukan mengganggu seperti glukosa,

seperti menetapkan standar. maka harus dilakukan per- lakuan berikut :

16.2.1.3 Metode Lowry

- Aliquot (ekstrak) didistri- Metode Lowry menghasilkan busikan ke dalam tabung

penghitungan protein lebih sensitif reaksi seperti pada pene-

dibandingkan metode Biuret.

tapan standar, kemudian Prinsip dari penetapan protein tambahkan air sampai vo-

dengan metode lowry dilakukan lume total masing-masing

berdasarkan terbentuk-nya warna

1 ml. biru yang dihasilkan dari reaksi - Kedalam masing-masing

antara Cu 2+ dengan ikatan peptida tabung reaksi tambahkan 1

dan reduksi asam fosfomolibdat ml trichloroacetic acid dan asam fosfo-tungstat oleh (TCA) 10 % sehingga tirosin dan triptofan (merupakan protein akan terdenaturasi

residu protein).

- Setrifus pada 300 rpm selama 10 menit sampai

Warna yang terbentuk terutama 100 ml HCl pekat ke dalam dari hasil reduksi fosfomolibdat

labu 2 liter.

dan fosfotungstat, oleh karena itu ƒ Campuran direfuks secara warna yang terbentuk tergantung

hati-hati selama 10 jam pada kadar tirosin dan triptofan

dengan menggunakan dalam protein.

kondensor. Sesudah di- dinginkan, tambahkan ke

Senyawa fenolik juga dapat dalam labu 150 g litium membentuk warna biru, sehingga

sulfat, 50 ml akuades dan akan mengganggu penghitungan.

beberapa tetes Br 2 (Brom). Untuk menghilangkannya lakukan

ƒ Pendidihan dilanjutkan la- pengendapan protein dengan

gi selama 10 menit de- TCA, hilangkan supernatan. La-

ngan tanpa kondenser, rutkan kembali protein yang

untuk menghilangkan ke- diendapkan oleh TCA, baru

lebihan Brom. dianalisis.

ƒ Setelah didinginkan, vo- lume larutan dijadikan 100 Pereaksi yang digunakan dalam

ml dan saring jika perlu. metode Lowry adalah :

ƒ Filtrat tidak boleh ada

1. Natrium karbonat 2% dalam warna kehijauan. Bila ada larutan NaOH 0.1N

maka perlu dilakukan pen-

2. Tembaga sulfat 0.5% dalam didihan sekali lagi. Ini larutan NaK tartrat 1 % (dibuat

merupakan ’reagent stok’. hanya pada waktu akan

Larutkan dengan air 1 : 1 digunakan).

sebelum digunakan.

3. Campuran 50 ml pereaksi (1)

5. Larutan protein standar 0.25 dengan 1 ml pereaksi (2) mg/ml (larutan bivine serum

(hanya pada waktu akan

albumin)

digunakan, hanya stabil sela- ma 1 hari)

4. Pereaksi Folin Ciocalteau (pe-

Cara Kerja :

reaksi fenol)

1. Pembuatan Kurva Standar

Pereaksi ini biasanya tersedia

a. Masukkan ke dalam tabung secara komersil, larutkan

reaksi : 0 (blanko), 0.1, 0.2, dengan air 1 : 1 sebelum

0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml digunakan. Pereaksi ini dapat

protein standar. Tambah air dibuat sendiri dengan cara

sampai volume total masing- sebagai berikut :

masing 4 ml. Kedalam ƒ Masukkan 100 g natrium

masing-masing tabung reaksi tungstat, 25 g natrium

tambahkan 5.5 ml pereaksi (3), molibdat, 500 ml akuades,

campur merata dan biarkan

50 ml asam fosfat 85% dan selama 10 – 15 menit pada suhu kamar.

b. Tambahkan 0.5 ml pereaksi (4) diukur densitas optisnya. De-ngan

ke dalam masing-masing menggunakan kurva stan-dar yang tabung reaksi, kocok merata

menyatakan hubungan antara dengan cepat setelah densitas optik dengan ka-dar penambahan.

protein yang ditetapkan de-ngan

c. Biarkan selama 30 menit metode Kjeldahl, maka ka-dar

sampai warna biru terbentuk. protein sampel dapat diten-tukan.

d. Ukur absorbansinya pada 650 nm

Pereaksi dan peralatan

e. Buat kurva standar. Pereaksi yang digunakan pada metode dye binding adalah la-

rutan dye. Larutan ini dibuat de- Lakukan seperti mempersiap-

2. Persiapan sampel

ngan melarutkan 0.6165 g amido kan sampel penetapan pro-tein

black atau 1 g orange G dalam 1 metode biuret.

liter asam sitrat 0.3 M.

3. Penetapan sampel

Adapun peralatan utama yang

0.1 – 1 ml sampel dipipet digunakan adalah sentrifus dan tepat, masukkan kedalam ta-

spektrofotometer. bung reaksi kemudian diperla- kukan seperti penetapan standar.