Koloni yang terpilih dari hasil kultur bakteri kemudian diisolasi dengan metode goresan kuadran. Cawan petri yang telah berisi media TSA steril yang
telah padat dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam, untuk mendapatkan koloni yang terpisah.
3.3.3 Identifikasi Bakteri
Identifikasi pada tahap awal dilakukan pemurnian dan pewarnaan Gram untuk melihat kemurnian bakteri. Pewarnaan Gram juga dilakukan untuk melihat
bentuk bakteri dan reaksi terhadap pewarnaan Gram. Bakteri yang sudah murni selanjutnya dilakukan uji biokimia untuk menentukan genus dan spesies dari
masing-masing bakteri Cowan 1974.
1 Pewarnaan Gram BSN 2009
Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara mengamati sel-sel bakteri yang telah mati dan diwarnai. Dengan cara tersebut, bentuk sel akan
menjadi lebih jelas karena warna sel dibuat kontras dengan medium disekelilingnya, sehingga lebih mudah dilihat dibawah mikroskop. Bakteri yang
mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil akan mudah dilihat. Pada pewarnaan Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu zat warna basa kristal violet, larutan
iodium lugol, alkohol dan safranin. Preparat bakteri ditetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan
selama satu menit, kemudian dibilas dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama satu menit, dicuci dengan air dan
dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 96 selama 10-20 detik atau sampai warna ungu tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar kemudian diwarnai dengan
larutan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air, kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop menggunakan minyak
imersi dan diamati bentuk sel serta reaksi Gram. Sel-sel bakteri yang tidak dapat melepaskan warna akan tetap berwarna seperti warna violet kristal, yaitu biru
ungu disebut bakteri Gram positif. Sel-sel bakteri yang dapat melepaskan violet kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah atau merah muda disebut
bakteri Gram negatif. Prosedur pewarnaan Gram BSN 2009 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 4.
2 Uji motilitas BSN2009
Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. reaksi positif
ditandai oleh adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar sedangkan untuk reaksi yang negatif menunjukkan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja.
Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis menggunakan ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam MIO media.
Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan
bakteri tidak menyebar,
hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak bergerak non motil.
Prosedur uji motilitas BSN 2009 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5.
3 Uji katalase BSN 2009
Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada bakteri, dimana enzim ini berperan dalam memecah hidrogen peroksida menjadi
air dan oksigen. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap kebutuhan akan oksigen. Secara aseptis diambil satu ose kultur bakteri dari agar
miring dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian diteteskan 1-3 tetes larutan H
2
O
2
3. Keberadaan enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung- gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun. Prosedur uji katalase
BSN 2009 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 6.
4 Uji oksidase BSN 2009
Uji oksidase berfungsi untuk menentukan oksidase sitokrom yang biasanya terdapat pada mikroorganisme patogen. Secara aseptis diambil satu ose
kultur bakteri lalu digoreskan pada kertas saring yang sudah diberi pereaksi oksidase
atau biasa digunakan juga stik oksidase. Hasil reaksi dinyatakan negatif jika tidak ada perubahan warna pada kertas saring dan dinyatakan positif jika
terjadi perubahan warna biru keunguan pada goresan dalam waktu singkat. Prosedur uji oksidase BSN 2009 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 7.
5 Uji oksidatif-fermentatif
BSN 2009
Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam menggunakan karbohidrat dengan cara fermentasi atau oksidasi. Bakteri yang
akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan ose diinokulasikan kedalam medium tegak yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan
diuji ditusukkan ke dalam dua tabung yang berisi media OF, tabung pertama ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa parafin. Inkubasi
dilakukan pada suhu 30 ºC selama 24 jam. Bila terjadi perubahan warna terbentuk warna kuning pada kedua tabung, maka bakteri bersifat fermentatif.
Bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna terbentuk warna kuning maka bakteri bersifat oksidatif sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna pada
kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif-fermentatif bersifat negatif. Prosedur
uji oksidatif fermentatifBSN 2009 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 8. 6 BBL crystal kit system
Bakteri kultur murni yang telah diperoleh, diidentifikasi untuk mengetahui jenis bakteri pada produk fermentasi telur ikan tambakan. Metode identifikasi ini
menggunakan kit BBL crystal yang di produksi oleh perusahaan BD Becton, Dickinson and Company
. Kit BBL crystal terdiri dari 29 microplates mikro cawan yang berisi substrat biokimia dan enzim. Pengujian menggunakan kit ini
berdasarkan pada kemampuan mikrobia dalam memanfaatkan dan mendegradasi substrat spesifik yang dapat dideteksi menggunakan berbagai macam sistem
indikator warna. Prosedur BBL Crystal ID GP secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 9.
Prinsip dari metode ini adalah menanam bakteri pada microplates mikro cawan. Kemampuan bakteri dalam menghidrolisis substrat akan menghasilkan
perubahan warna dalam lubang mikro yang dapat terdeteksi secara visual. Data warna-warna yang telah diperoleh akan dicocokkan pada tabel warna yang
memiliki nilai tertentu. Nilai-nilai tersebut selanjutnya dimasukkan dalam bank data software BBL crystal dan diperoleh hasil identifikasi bakteri hingga tingkat
spesies. Tahapan pengujian mikrobiologi fermentasi telur tambakan dapat dilihat pada Gambar 6.
Telur tambakan fermentasi
ditimbang 10 gram
digerus + 90 ml pengencer
suspensi
pengenceran secara desimal 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
TSA + 0; 5; 10 NaCl A
Inkubasi 37 C 24 jam
Penghitungan koloni
Isolasi koloni bentuk, penampakan, warna
Pemurnian isolat metode gores
B Isolat pada agar miring
Uji morfologi dan fisiologi
identifikasi Gambar 6 Diagram alir pengujian mikrobiologi kuantitatif A dan kualitatif B.
3.3.4 Analisis kimia 1 Pengukuran nilai pH AOAC 1995
