Uji oksidatif – fermentatif BBL Crystal kit system

reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D- phenylenediamine dihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa hasil uji yang dilakukan negatif Irianto 2008. Enzim oksidase mempunyai peranan penting pada sistem transpor elektron selama respirasi aerobik. Enzim oksidase sitokrom berperan sebagai katalisator dalam transfer atom hidrogen dari sitokrom yang terakhir ke molekul oksigen. Sitokrom merupakan senyawa organik yang terdapat dalam sel hidup dan berperan dalam transfer atom hidrogen dari substrat ke molekul oksigen membentuk air. Bakteri aerob, beberapa bakteri anaerobik fakultatif dan mikroarofilik, menunjukkan adanya aktivitas karena memiliki oksidase Cappucino dan Sherman 1983 diacu dalam Prihardini 2008.

4.3.5 Uji oksidatif – fermentatif

Uji oksidatif-fermentatif bertujuan untuk mengetahui sifat oksidasi atau fermentasi bakteri terhadap gula. Uji ini juga berguna untuk membedakan bakteri oksidatif dan bakteri fermentatif serta untuk melihat kemampuan bakteri dalam mencerna karbohidrat dalam situasi aerob dan anaerob Lukistyowati dan Riauwaty 2005. Berdasarkan hasil uji oksidatif-fermentatif, isolat iso 1 tidak mengalami reaksi oksidatif fermentatif, iso 2 mengalami reaksi oksidatif fermentatif, iso 3.4.5 hanya mengalami reaksi fermentati. Hasil reaksi oksidatif fermentatif dan yang tidak mengalami reaksi oksidatif dan fermentatif dari kiri ke kanan kiri ke kanan dapat dilihat pada Gambar 11. Gambar 11 Hasil reaksi oksidatif fermentatif dan non-oksidatif fermentatif. Fermentasi adalah suatu reaksi reduksi – oksidasi di dalam biologi yang menghasilkan energi, dimana donor dan aseptor elektron yang digunakan adalah senyawa organik. Senyawa organik yang umumnya digunakan adalah karbohidrat dalam bentuk glukosa. Saat keadaan anaerobik, senyawa tersebut akan diubah oleh reaksi reduksi-oksidasi dengan katalis enzim menjadi senyawa asam. Sel-sel yang melakukan fermentasi mempunyai enzim-enzim yang akan mengubah hasil reaksi reduksi-oksidasi tersebut menjadi suatu senyawa yang mempunyai muatan lebih positif sehingga dapat menangkap elektron atau bertindak sebagai aseptor elektron terakhir dan menghasilkan energi Winarno dan Fardiaz 1984 diacu dalam Candra et al. 2007.

4.3.6 BBL Crystal kit system

Identifikasi bakteri adalah membandingkan sifat-sifat bakteri yang belum teridentifikasi dengan sifat-sifat bakteri sesuai dengan kunci identifikasi bakteri. Hasil karakterisasi kelima isolat murni dicocokkan dengan panduan buku manual dan literatur hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya. Kelima isolat yang telah diisolasi diidentifikasi spesiesnya dengan menggunakan sistem BBL crystal kit. BBL crystal adalah alat identifikasi bakteri dengan prinsip menanam bakteri pada microplates lubang mikro yang berisi berbagai substrat biokimia dan enzim. Aktivitas bakteri dalam menghidrolisis substrat tertentu akan mengubah kandungan warna dalam lubang mikro sehingga didapatkan data warna-warna yang akan dicocokkan pada tabel warna yang memiliki nilai tertentu. Nilai-nilai tersebut akan dimasukkan dalam bank data software BBL crystal sehingga didapatkan hasil identifikasi bakteri hingga Oksidatif - Fermentatif Non Oksidatif - Fermentatif tingkat spesies. Sebelum melakukan uji BBL crystal kit, dipilih dahulu jenis BBL crystal kit yang sesuai dengan hasil pewarnaan Gram agar mempermudah dalam identifikasi hingga tingkat spesies. Apabila hasil dari pewarnaan gram menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam Gram positif, maka menggunakan BBL crystal Gram positif. Apabila hasil dari pewarnaan Gram menunjukkan bahwa bakteri bersifat Gram negative, maka menggunakan BBL crystal Gram negative. Bakteri yang bersifat anaerob diuji menggunakan BBL crystal kit anaerob. Uji pewarnaan Gram menunjukkan bahwa bakteri yang diperoleh merupakan bakteri Gram positif, sehingga menggunakan BBL crystal ID kit Gram positif. BBL crystal ID kit Gram positif memiliki 30 microplates lubang mikro yang mengandung substrat yang didehidrasi. Bakteri yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu dalam media TSA selama 24 jam. Bakteri yang tumbuh pada media TSA diambil menggunakan jarum ose steril dan dilarutkan dalam medium cair BBL crystal hingga mencapai kekeruhan 0,5 McFarland standar sesuai standar kekeruhan BBL crystal. Detail standar McFarland dapat dilihat pada Lampiran 15. Lubang mikro BBL crystal GP diisi oleh cairan medium sebanyak 0,15 ml pada tiap lubang, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Sifat biokimia dari kelima isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel 2. Teori dari identifikasi bakteri dengan teknik konvensional adalah membandingkan bakteri yang sedang diidentifikasi dengan bakteri yang telah teridentifikasi sebelumnya. Apabila tidak terdapat bakteri yang ciri-cirinya 100 serupa, maka dilakukan pendekatan terhadap bakteri yang memiliki ciri-ciri yang paling menyerupai. Hasil perubahan warna dan sinar UV ultra violet setelah diinkubasi dapat dilihat pada Lampiran 16. Oleh karena itu, teknik identifikasi dengan metode konvensional selalu menghasilkan suatu bakteri tertentu yang sudah teridentifikasi sebelumnya dan tidak dapat menemukan spesies baru Cowan 1974. Kunci identifikasi bakteri Gram positif Cowan 1974 dapat dilihat pada Lampiran 17. Hasil identifikasi bakteri dapat dilihat pada Tabel 3 dan detail hasil identifikasi BBL crystal isolat 1-5 dapat dilihat pada Lampiran 18-22. Hasil perubahan warna dan sinar serta hasil identifikasi bakteri disajikan pada Lampiran 23. Tabel 2 Sifat biokimia dari kelima isolat bakteri Pengamatan uji biokimia Isolat Bakteri Cowan 1974 Ballows 1991 Babay 2001 Cowan 1974 Ballows 1991 Iso 1 Iso 2 Iso 3 Iso 4 Iso 5 BM LACA CP LBBS Gram + + + + + + + + + - Bentuk sel batang batang batang batang batang batang batang batang batang Katalase + - + + + + + + + Oksidase + + + + + + ND ND ND OF - OF F F F - ND ND ND Motilitas + - - - - + + + b ND + Trehalose + - - - - ND ND - ND Lactose - - - - - + a + b - ND Methyl- α β-glucoside - - - - - + a + + b - - - Sucrose + - - - - + a + - b - - Mannitol + - - - - + - a + + b - - - Maltotriose - - - - - ND ND - ND Arabinose - - - - - + - a ND - - - Glycerol - - - - - ND ND - ND Fructose + - - - - + a ND - ND Urea - - + + + + - - b - + Esculin + - - - - ND - + b ND ND Identity bedasarkan literatur BM= 82 LACA= 58 CP = 76 LSBS = 52 LSBS = 52 Faktor kepercayaan BBL crystal BM=99 LACA= 95 CP=66 LSBS= 98 LSBS= 98 Keterangan : BM = Bacillus megaterium, LACA = Leifsonia aquatica Coryebacterium aquaticum, CP = Corynebacterium propinquum, LSBS = Lysinibacillus sphaericus Bacillus sphaericus. ND = tidak ada data. O = oksidatif, F = fermentatif, a = Sanni et al. 2002, b = Giammanco et al. 2006, 37 Tabel 3 Hasil identifikasi bakteri Isolat Jenis bakteri teridentifikasi Iso 1 Bacillus megaterium Iso 2 Leifsonia aquatica Iso 3 Corynebacterium propinquum Iso 4,5 Lysinibacillus sphaericus Bacillus megaterium Isolat iso 1 yang diuji menggunakan BBL crystal ID teridentifikasi sebagai bakteri B. megaterium. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, menghasilkan spora, banyak ditemukan dalam tanah dan daerah permukaan. Bakteri ini dapat bertahan hidup dalam kondisi ekstrim. Bacillus megaterium jua dapat memproduksi penisilin amidase sehingga dapat digunakan dalam industri pembuatan penisilin Glogowski 2010. Klasifikasi bakteri B. megaterium menurut kamus klasifikasi bakteri yang diacu dalam Glogowski 2001 adalah sebagai berikut: Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Bacillales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : B. megaterium Sanni et al. 2002 menyatakan bahwa hasil produk fermentasi yang berasal dari Ghana yaitu momoni. Momoni adalah produk fermentasi yang terbuat dari ikan air tawar yang ditambahkan garam sebanyak 30 dan umumnya digunakan sebagai bumbu penyedap dimakanan seperti yam, cocoyam, dan apentum . Hasil bakteri yang telah diisolasi pada momoni adalah bakteri dari jenis Bacillus yaitu Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis dan Bacillus megaterium . Bakteri dari spesies Bacillus ini dapat tumbuh dalam kondisi garam dengan konsentrasi tinggi dan keberadaanya dalam jumlah besar dapat menghasilkan sumber energi seperti protein. 38 Bacillus megaterium biasanya terdapat pada produk fermentasi, seperti kecap ikan, dan terasi Adawyah 2008. Anihouvi et al. 2007 menyatakan bahwa bakteri dari spesies Bacillus termasuk dalam golongan halofilik karena dapat tumbuh dalam kondisi garam dengan konsentrasi tinggi dan dapat memanfaatkan protein sebagai sumber energi. Hal ini berarti bakteri ini bersifat proteolitik, hasil aktivitas proteolitik ini dapat membentuk aroma dan flavor pada produk fermentasi. Sekhon et al. 2006 menambahkan bahwa Bacillus megaterium juga mampu menghasilkan lipase pada kisaran pH 4-11 dan menghasilkan lipase tertinggi pada kisaran pH 6,5-8. Leifsonia aquatica Uji isolat iso 2 berdasarkan data bank BBL crystal diperoleh data bahwa isolat iso 2 merupakan bakteri Leifsonia aquatica. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, bakteri non-motil. Luckman dan Wehle 2007 menyatakan bahwa bakteri Leifsonia aquatica ini merupakan bakteri dari turunan Corynebacterium aquaticum. Klasifikasi bakteri menurut Leifsonia aquatica menurut Garrity 2006. Kingdom : Bacteria Filum : Actinobacteria Kelas : Actinobacteria Ordo : Actinomycetales Famili : Noctuoidea Genus : Leifsonia Spesies : Leifsonia aquatica Leifson 1962 dalam Luckman dan Wehle 2007 menyatakan bahwa Leifsonia aquatica merupakan bakteri Gram positif yang berbentuk batang sering ditemukan dalam air suling, tebu dan kolam. Spesies Leifsonia memilki koloni agak keruh dan berwarna kuning dan dapat tumbuh pada suhu 35-37 C. Leifsonia aquatica merupakan bakteri turunan Corynebacteria, bakteri Corynebacteri merupakan bakteri yang dapat menghasilkan indol, dapat memproduksi nitrat menjadi nitrit dan pada fermentasi karbohidrat dapat menghasilkan gas dan memfermentasi gula serta dapat menghidrolisis protein Burkovski 2008. Shewan 1977 diacu dalam Kaseger 1986 diacu dalam Sumanti 1988 menyatakan bahwa salah satu mikroba yang terdapat pada kulit ikan adalah bakteri jenis Coryneform, sehingga diduga dalam proses pembuatan bekasang jenis Corynebacterium terikut dan dapat tahan hidup pada kondisi lingkungan yang mengandung garam. Beberapa spesies dari Corynebacterium telah digunakan untuk memproduksi asam amino, termasuk asam L-glutamat yang merupakan bahan tambahan pada makanan. Jalur metabolisme pada Corynebacterium dimanipulasi untuk menghasilkan L-Lisin dan L-treonin Burkovski 2008. Corynebacterium propinquum Isolat iso 3 diidentifikasi sebagai bakteri Corynebacterium propinquum. Babay 2001 menyatakan bahwa bakteri ini merupakan Gram positif, berbentuk batang, tidak memiliki spora dan non motil. Koloni bakteri ini berwarna koloni putih dan bersifat katalase positif, dapat menghidrolisis tirosin tetapi tidak dapat menghidrolisis urea atau eskulin serta tidak memfermentasi gula. Spesies Corynebacterium yang non-patogen banyak digunakan oleh industri makanan untuk memproduksi asam amino asam glutamat. Corynebacterium dari spesies C. glutamicum banyak digunakan oleh industri untuk menghasilkan asam glutamat yang digunakan sebagai penyedap makanan Burkovski 2008. Klasifikasi bakteri Corynebacterium propinquum menurut Garrity 2006 adalah: Domain : Bacteria Kingdom : Bacteria Filum : Actinobacteria Kelas : Actinobacteria Subkelas : Actinobacteridae Ordo : Actinomycetales Subordo : Corynebacterineae Famili : Corynebacteriaceae Genus : Corynebacterium Specific descriptor : propinquum Nama ilmiah : Corynebacterium propinquum Corynebacteria merupakan bakteri aerob atau fakultatif anaerob, non motil dan katalase positif. Mayoritas bakteri ini tidak semua spesies dari jenis Coryne dapat memfermentasi karbohidrat dan asam laktat sebagai hasil sampingnya Murray 2005. Lysinibacillus sphaericus Pada isolat iso 4 dan iso 5 yang teridentifikasi berupa bakteri Lysinibacillus sphaericus. Baumann et al. 1991 diacu dalam Josic et al. 2008 menyatakan bahwa bakteri ini juga dikenal sebagai Bacillus sphaericus. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, non motil, mesofilik dan banyak terdapat di tanah. Bakteri ini dapat memetabolisme berbagai senyawa organik dan asam amino akan tetapi tidak dapat memetabolisme gula. Lysinibacillus sphaericus adalah bakteri yang banyak terdapat ditanah dan air, dalam kondisi yang ekstrim dapat membentuk endospora, tahan terhadap panas, bahan kimia dan sinar ultraviolet. Spora dari bakteri ini dapat bertahan lama walaupun bersifat fakuktatif anaerob dan dalam kondisi tertentu bisa bersifat anaerob. Klasifikasi bakteri Lysinibacillus sphaericus menurut kamus klasifikasi bakteri yang di acu dalam Samani et al. 2010 adalah sebagai berikut : Domain : Bacteria Kingdom : Bacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Bacillales Famili : Planococcaceae Genus : Lysinibacillus Species : Lysinibacillus sphaericus Dikenal juga sebagai Bacillus sphaericus Pada tahun 1987 seorang peneliti dari cina Pei G telah mengisolasi bakteri ini dari sarang nyamuk, bakteri ini dapat menghasilkan racun insektisida mirip dengan yang dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis. Bakteri ini tidak dapat memetabolisme polisakarida diduga karena kurangnya transporter dan enzim tetapi dapat metabolisme berbagai senyawa organik lain dan asam amino Samani et al. 2010.

4.4 Sifat Kimiawi Telur Ikan Segar dan Produk Fermentasi Telur Ikan Tambakan