Sterilisasi alat Pembuatan media tanam

3.4.1 Sterilisasi alat

Botol kultur dan perlengkapan penanaman berupa petri dish, scapel, pinset bengkok dan lurus dicuci menggunakan cairan liqui-nox dengan bantuan spon busa dan gumpalan kawat untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada peralatan tersebut. Setelah pembersihan menggunakan cairan liquinox kemudian semua botol dan peralatan dibilas menggunakan aquades untuk menghilangkan sisa-sisa cairan pembersih yang masih menampel. Botol dan perlengkapan penanaman ditiriskan di keranjang berongga agar air sisa pencucian sebagian jatuh. Jika botol akan disterilkan pada hari yang berbeda maka botol disimpan di tempat bersih dan tertutup dalam mulut botol berada di bawah terbalik. Khusus peralatan yang terbuat dari besi setelah pembilasan terakhir harus segera dikeringkan menggunakan tissue untuk mencegah timbulnya karat akibat oksidasi besi dengan air sisa pencucian begitu juga dengan petri dishharus segera dikeringkan untuk mencegah timbulnya bercak-bercak tetesan air. Sterilisasi berikutnya menggunakan bantuan autoclave . Sebelum menata botol kultur pastikan air rebus cukup untuk proses sterilisasi selama satu jam. Botol kultur disusun rapi dan rapat dalam autoclave dengan posisi terbalik. Perlengkapan penanaman disusun sesuai kebutuhan dan dikelompokkan sesuai fungsinya seperti pinset dan scapel dibungkus menjadi satu wadah. Langkah selanjutnya dibungkus rapi dalam kertas HVS dan diberi label nama alat dan tanggal sterilisasi. Strerilisasi peralatan dalam autoclave dilakukan selama satu jam dengan tekanan 17,5 psi dan suhu 121°C. Autoclave dioperasikan dalam keadaan exhaust valve katup pembuangan terbuka hingga uap air keluar selama 5 menit, hal ini untuk membuang uap air awal yang masih mengandung kotoran-kotoran yang dapat menyebabkan kontaminasi. Botol dan peralatan yang sudah disterilisasi langsung disimpan dalam wadah tertutup untuk mengurangi kontak dengan udara luar terlalu lama.

3.4.2 Pembuatan media tanam

Pertama menyiapkan alat dan bahan dalam meja kerja. Penataan botol steril di meja dilakukan secepat mungkin kemudian ditutup dengan lembaran kertas untuk mencegah kontaminan masuk selama masa pembuatan media. Semua bahan ditimbang menggunakan neraca digital dengan berat sebagai berikut. Tabel 1. Penggunaan bahan untuk pembuatan media tanam Bahan Berat gram MS Instan 4,43 Gula pasir 30 Agar-agar 7 setelah seluruh bahan selesai ditimbang kemudian dicampur ke dalam satu liter air mineral aduk hingga merata.Langkah selanjutnya mengukur pH menggunakan pH indikator, pastikan didapatkan berkisar pH 5-6. Kemudian panaskan menggunakan hot plate hingga mendidih, selama proses pemanasan larutan harus tetap diaduk agar semua bahan tercampur dengan sempurna. Pemberian BAP dan TDZ sesuai dengan taraf yang direncanakan, larutan BAP yang digunakan adalah BAP 1 ppm dan BAP 2 ppm, TDZ yang digunakan adalah TDZ 0,05 ppm, 0,1 ppm dan 0,5 ppm. Pencampuran antara media dasar dengan hormon diaduk hingga merata. Penuangan dilakukan menggunakan wadah tuang yang berujung lancip untuk memudahkan masuknya larutan ke dalam botol. Volume penuangan kurang lebih 10 ml tiap botol. Botol yang telah terisi media segera ditutup menggunakan plastik dengan ukuran 10 cm x 10 cm kemudian ikat dengan karet untuk mencegah kontaminan masuk, pengikatan dengan karet sebaiknya tidak terlalu rapat untuk mencegah plastik bocor saat proses sterilisasi dengan tekanan dan suhu tinggi. Proses sterilisasi media langkahnya sama dengan sterilisasi alat, hanya saja lama proses dikurangi menjadi 20 menit. Media yang sudah steril selanjutnya ditambah ikatan karet dan ditempatkan pada wadah tertutup kemudian disimpan selama 3 hari untuk memastikan media tidak mengalami kontaminasi.

3.4.3 Sterilisasi lingkungan kerja