molekul kecil akan tertahan oleh kolom lebih lama Koolman 2005. Batas pemisahan dari sebuah ukuran merupakan indikasi bobot molekul untuk tipe
polimer Hagel 1998. Keuntungan dari metode ini adalah dapat memisahkan dengan baik molekul
besar dari molekul kecil serta dapat menggunakan berbagai pelarut tanpa harus mengganggu proses pemisahan. Penggunaan kromatografi gel filtrasi ini akan
didapatkan pemisahan yang baik, sensitifitas yang baik, dan waktu yang diperlukan untuk pemisahan cepat. Selain itu tidak ada sampel yang tertinggal
karena pelarut tidak berinteraksi dengan fase diam Skoog 2006. Namun Kehilangan molekul dapat terjadi selama proses pemurnian dengan menggunakan
teknik kromatografi gel filtrasi karena autolisis Scopes 1987. Prinsip dasar kromatografi gel filtrasi adalah partikel dengan ukuran yang
berbeda akan dielusi melalui fase stasioner pada tingkat yang berbeda. Hal ini menyebabkan pemisahan partikel berdasarkan ukuran. Setiap kolom memiliki
jangkauan berat molekul yang dapat dipisahkan. Molekul besar tidak dapat terjebak dalam matriks fase diam sehingga akan terlebih dahulu terlewati kolom.
Bobot molekul menengah dan kecil terjebak dalam matriks sehingga akan lebih lama untuk terlewati fase diam Skoog 2006.
2.7.2 Kromatografi ion-exchange
Kromatografi penukaran ion ion-exchange chromatography biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis. Purwadaria 1999 menjelaskan
bahwa pada sistem kromatografi ini, molekul senyawa dipisahkan berdasarkan perbedaan afinitas terhadap penukar ion. Afinitas molekul dengan penukar ion
dapat dilepaskan dengan mengubah kadar garam atau pH larutan eluen. Selain itu sistem pengaturan perubahan kadar garam atau pH eluen baik dengan gradasi
linier ataupun gradasi bertingkat dapat pula mempengaruhi jumlah molekul yang terpisah.
Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar planar. Terdapat dua tipe penukaran ion, yaitu penukaran kation
cation exchange dan penukaran anion anion exchange. Pada penukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif sedangkan pada penukaran anion, fase stasioner
bermuatan positif, dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Kromatografi ion-exchange Harper 2005. Muatan-muatan molekul akan memiliki sifat ketika muatan molekul yang
sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi, namun muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk
ikatan ionik dengan kolom Carrier 1997. Prinsip dasar yang digunakan adalah molekul dengan muatan positif bersih pada pH tertentu akan berikatan dengan
gugus fungsional bermuatan negatif seperti carboxylates atau sulfat penukar kation. Demikian pula, molekul bermuatan negatif bersih berikatan dengan
molekul bermuatan positif pada gugus fungsional, biasanya tersier atau kuaterner amina penukar anion.
2.7.3 Kromatografi lapis tipis
Kromatografi Lapis Tipis KLT dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain
kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis
tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam uniform pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik
Gandjar Rohman 2007. Teknik ini biasa digunakan untuk memisahkan komponen dari suatu campuran senyawa organik alam, sintetis, dan campuran
kompleks anorganik. Fase gerak yang digunakan tergantung dari senyawa yang ingin dipisahkan Harjadi 1976.
Pemisahan komponen melalui berbagai tahap. Pertama dilakukan pemisahan sampel dengan penotolan pada plat silika yang telah didesain. Plat silika pada
bagian bawah diberi sebuah garis untuk menandakan posisi awal penotolan.
Selanjutnya dibuat pula sebuah garis akhir menggunakan pensil. Jarak antara garis awal dengan garis akhir biasanya 5 cm. Plat yang telah ditotol dengan sampel
dimasukkan ke dalam bejana pengembang yang telah terdapat eluen hasil proses penjenuhan yang dilakukan selama 20 menit. Penjenuhan berfungsi agar eluen
lebih efektif dalam memisahkan komponen tersebut. Eluen akan memisahkan komponen hingga garis akhir yang telah didesain. Semakin dekat kepolaran antara
sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut Wilson Walker 1994. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Kromatografi lapis tipis Tissue 1996. Tahapan selanjutnya adalah visualisasi atau deteksi. Deteksi atau visualisasi
sampel yang tidak berwarna dapat menggunakan dua cara, yaitu penyinaran dengan sinar UV 254 nm dan 356 nm dan pereaksi kimia ninhidrin, FeSO
4
, Dragendroff, dan anilin. Pada saat disinari dengan sinar UV, komponen yang
terpisahkan akan terlihat seperti spot atau bidang kecil yang berwarna gelap. Deteksi komponen juga dapat dilakukan dengan menempatkan kromatogram pada
bejana tertutup yang telah dijenuhkan dengan kristal iod. Uap kristal iod bereaksi dengan komponen yang terpisahkan dan terlihat seperti bercak-bercak kecoklatan.
Aplikasi dari teknik ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif membandingkan retardation factor R
f
senyawa murni dengan komponen, pola sidik jari, dan menentukan jumlah komponen dan preparatif untuk memperoleh
senyawa murni. Nilai R
f
yang akan dihasilkan dari suatu senyawa bernilai sama meskipun jarak plat yang digunakan berbeda Wilson Walker 1994.
2.7.4 Kromatografi cair kinerja tinggi
