Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV Utama et al. 2000

kolom kromatografi, SDS-PAGE, tabung vial, hot plate magnetic stirer, dan timbangan digital.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap satu yaitu preparasi RNA helikase HCV yang meliputi 1 ekspresi RNA helikase dengan cara menumbuhkan bakteri E. coli BL21 DE3 pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET 21b Utama et al. 2000, 2 pemurnian RNA helikase yang telah terekspresi pada sel bakteri menggunakan kromatografi afinitas Utama et al. 2000. Tahap dua meliputi 1 kultivasi mikroalga BTM 11 dalam media IMK-Sea Water pada suhu ruang dengan pencahayaan 4800 lux, 2 ekstraksi polisakarida dari biomassa mikroalga BTM 11 Wang et al. 2004. Tahap tiga meliputi 1 pemurnian ekstrak polisakarida menggunakan teknik kromatografi gel filtrasi dan kromatografi ion-exchange, 2 penentuan profil senyawa polisakarida inhibitor yang paling aktif menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi. Diagram alir prosedur kerja penelitian dapat dilihat pada Gambar 11.

3.3.1 Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV Utama et al. 2000

Ekspresi RNA helikase protein NS3 HCV dilakukan berdasarkan metode Utama et al. 2000. Ekspresi dilakukan pada skala 400 mL. Sebanyak 10 µ L stok gliserol bakteri E. coli BL21 DE3 pLysS yang membawa vektor ekspresi pET- 21bHCV NS3 helikase diinokulasi ke dalam 10 mL medium LB cair yang mengandung 1 µgmL ampisilin, kemudian dikultur selama satu malam dalam inkubator goyang shaker incubator pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm. Hasil kultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang mengandung ampisilin, selanjutnya dikultur dalam inkubator berpenggoyang pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30 menit sampai dengan 1 jam hingga OD 600 mencapai ±0,3. Apabila OD 600 telah mencapai ±0,3 maka ditambahkan 0,3 M isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase IPTG. Kultur E. coli BL21 DE3 pLysS kemudian diinkubasi selama 3 jam dalam inkubator goyang pada suhu 37 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD 600 mencapai ±1. Gambar 11 Diagram alir prosedur kerja penelitian. Mikroalga BTM 11 Kultivasi mikroalga BTM 11 Biomassa Mikroalga BTM 11 Ekstraksi polisakarida Ekstrak polisakarida Pemurnian polisakarida kromatografi gel filtrasi Pemurnian polisakarida kromatografi ion-exchange Uji ATPase Analisis total gula Analisis total gula Uji ATPase Fraksi paling aktif polisakarida terpurifikasi Analisis kemurnian kromatografi lapis tipis Analisis kemurnian kromatografi cair kinerja tinggi Uji ATPase E.coli BL 21DE3 pLysS pembawa gen helikase Ekspresi dan purifikasi enzim helikase RNA helikase terpurifikasi SDS PAGE Uji ATPase Hasil kultur disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair, kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20 °C. Pelet E. coli BL21 DE3 pLysS dipecah dengan metode freeze thaw sebanyak 3 kali ulangan yaitu dengan membekukan pelet pada suhu -20 °C selama 30 menit, lalu dicairkan pada suhu ruang selama 30 menit. Pelet kemudiian diresuspensi dengan 20 mL larutan bufer B Tris HCl 10 mM pH 8,5; NaCl 100 mM, Tween 20 0,25. Tahap kedua pemecahan sel dilakukan dengan metode sonikasi Amplitudo 40; siklus 0,5; waktu 3x15 detik; interval waktu 1 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil untuk tahapan selanjutnya, sedangkan pelet disimpan untuk analisis SDS-PAGE. Enzim RNA helikase yang diduga berada dalam supernatan dipurifikasi menggunakan metode kromatografi afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µ L resin TALON, kemudian dilakukan tahap pengikatan binding menggunakan rotator selama 3 jam dalam ruang pendingin 4 °C. Sampel selanjutnya disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 7 menit. Supernatan inner volume disimpan pada suhu 4 °C untuk analisis SDS-PAGE. Pelet resin binding diresuspensi dengan 10 mL larutan bufer B dan disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.500 rpm selama 5 menit. Tahapan ini dilakukan sebanyak 2 kali sehingga diperoleh 2 larutan supernatan washing 1 washing 2 yang disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk analisis SDS-PAGE. Resin binding dari hasil washing 2 kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin. Elusi dilakukan dengan menambahkan 150 µ L larutan bufer elusi imidazol 400 mM dalam bufer B, kemudian diinkubasi menggunakan rotator dalam ruangan pendingin 4 °C selama satu malam. Sampel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang mengandung enzim dipindahkan dalam eppendorf yang baru E1, sedangkan pelet ditambahkan 75 µ L larutan bufer elusi, kemudian diinkubasi dengan menggunakan rotator selama 1 jam. Sampel kembali disentrifugasi sehingga diperoleh supernatan E2. Supernatan E1 dan E2 disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan untuk analisis ATPase dan SDS-PAGE.

3.3.2 Kultivasi dan pemanenan mikroalga BTM 11