dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution Buffer Elektroforesis SDS 1X pH 8,3.
Masing-masing sampel diambil 4 µ L lalu dicampur dengan 2 µ L loading dye Lampiran 2c. Campuran didenaturasi pada suhu 95 °C selama 15 menit.
Marker protein BIORAD
®
sebanyak 4 µ Lgel dimasukkan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur dengan loading dye, dimasukkan ke
dalam well sebanyak 5 µ Lwell.Gel dielektroforesis selama 90 menit dengan arus 40 mA. Gel diangkat lalu direndam dalam Commasie Blue G-250 staining
solution Lampiran 2d selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-250 destaining solution Lampiran 2e ±20
menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H
2
O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4 °C.
Gel menunjukkan elektroforegram dari RNA helikase HCV berupa pita protein dengan bobot molekul 54 kDa. Perhitungan bobot molekul BM
dilakukan terlebih dahulu dengan menghitung retardation factor R
f
dari masing- masing pita protein marker dan pita protein target menggunakan rumus :
Nilai R
f
pada pita-pita protein marker digunakan untuk memperoleh kurva standar terhadap log standar BM dari marker. Bobot molekul dihitung melalui
persamaan regresi linier kurva standar yang diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “x” yang dimasukkan merupakan nilai R
f
dari pita protein target, sedangkan nilai “y” merupakan nilai log BM dari pita protein target. Nilai bobot molekul diperoleh
dari antilog BM pita protein target.
3.4.2 Uji aktivitas ATPase RNA helikase HCV Utama et al. 2000
Pengujian aktivitas inhibisi enzim helikase virus hepatitis C dengan sampel hasil pemurnian polisakarida BTM 11 menggunakan uji ATPase kolorimetri
Utama et al. 2000, yaitu dengan mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP dan fosfat anorganik Pi. Konsentrasi
akhir reaksi adalah sebesar 175 µ Lsumur.Sistem reaksi enzim selengkapnya untuk satu sampel dengan volume total 175 µ L dapat dilihat pada Tabel 2.
Rf = Jarak dari titik awal elektroforesis ke pita protein
Jarak dari titik awal ke titik akhir elektroforesis
Tabel 2 Sistem reaksi enzim untuk satu sampel dengan volume total 175 µ L Blanko µ L Enzim µ L
Kontrol - µ L Sampel µL
Sampel Pelarut
H
2
O Buffer MOPS
Kofaktor MgCl
2
Substrat ATP RNA helikase
- -
43,5 5
0,5 1
- -
- 38,5
5 0,5
1 5
- 5
33,5 5
0,5 1
5 5
- 33,5
5 0,5
1 5
Inkubasi pada suhu ruang selama 45 menit Dye solution
100 100
100 100
Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit Na-sitrat
25 25
25 25
Pembacaan pada λ 620 nm dengan referensi 405 nm Abs. 620 nm – 405 nm H
2
O : hijau malakit : polivinil alkohol : amonium molibdat 2 : 2 : 1 : 1 Persentase aktivitas penghambatan senyawa inhibitor terhadap RNA
helikase ditentukan dengan rumus:
Keterangan : A = Absorbansi RNA helikase tanpa senyawa inhibitor
I = Absorbansi RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor
3.4.3 Analisis kandungan gula fraksi polisakarida BTM 11 Dubois et al. 1956
Analisis ini bertujuan untuk memastikan bahwa fraksi aktif dari kromatografi gel filtrasi dan ion-exchange terdapat kandungan polisakarida
dengan cara mendeteksi komponen gula penyusunnya menggunakan metode fenol-asam sulfat. Langkah awal yaitu membuat kurva standar dengan glukosa
1 mgmL sebagai standar dari konsentrasi tertinggi hingga terendah. Sebanyak 0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; dan 1 mgmL glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 µ L. Sebanyak 0,5 mL larutan fenol 5; 2,5 mL H
2
SO
4
pekat dicampurkan ke dalam tabung tersebut dan dicampur rata. Standar glukosa diganti dengan akuades untuk blanko, sedangkan
untuk analisis sampel, standar diganti dengan polisakarida 1. Setelah itu campuran diinkubasi selama 15 menit di ruang asam. Lalu tabung berisi campuran
diinkubasi dalam waterbath 40 °C selama 15-30 menit, dan diamati perubahan warna yang terjadi. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 490 nm.
Kandungan gula dihitung melalui persamaan regresi linier kurva standar yang
Inhibisi = A
− I A
× 100
diperoleh, yaitu y = ax + b . Nilai “y” yang dimasukkan merupakan absorbansi
yang terbaca dari sampel, sedangkan nilai “x” merupakan kandungan gula dalam sampel.
16
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekspresi dan Pemurnian RNA Helikase Virus Hepatitis C
