16
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekspresi dan Pemurnian RNA Helikase Virus Hepatitis C
Ekspresi dan pemurnian RNA helikase HCV dilakukan untuk memperoleh RNA helikase HCV murni yang dapat digunakan dalam pengujian aktivitas
polisakarida inhibitor terhadap aktivitas ATPase. Ekspresi RNA helikase HCV dilakukan pada bakteri Escherichia coli BL21 DE3 pLysS dalam plasmid pET
21b. Sambrook Russell 2001 menjelaskan bahwa E. coli BL21 DE3 pLysS merupakan sel kompeten yang bersifat resisten terhadap antibiotik kloramfenikol
dan berperan sebagai sel inang pada ekspresi gen, sedangkan pET 21b pada ekspresi gen berperan sebagai vektor ekspresiyang memiliki sifat resisten
terhadap antibiotik ampisilin. Ekspresi RNA helikase diawali dengan penumbuhan bakteri E. coli BL21
DE3 pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase virus hepatitis C dalam plasmid pET 21b ke dalam 10 mL media Luria-Bertani LB yang sudah
ditambahkan ampisilin. Penggunaan media ini dipilih karena media LB merupakan media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri, termasuk E.coli
dikarenakan pertumbuhan yang relatif cepat dan rendemen yang lebih baik Sezonov et al. 2007. Penambahan ampisilin bertujuan sebagai penanda seleksi
untuk membedakan E. coli rekombinan yang membawa gen NS3 helikase HCV dengan bakteri lain yang tidak membawa gen NS3 helikase HCV. Tahap ini
merupakan pembuatan prekultur yang bertujuan untuk menyegarkan kembali stok biakan bakteri ke dalam media baru sehingga dapat tumbuh dengan optimal ketika
dikultur ke skala yang lebih besar. Prekultur diinkubasi selama satu malam di inkubator berpenggoyang dengan suhu 37 °C pada kecepatan 150 rpm. Warna
kultur yang berubah menjadi kuning keruh menunjukkan bahwa bakteri E.coli BL21 DE3 pLysS berhasil ditumbuhkan.
Prekultur yang telah siap, dipindahkan ke dalam LB yang sudah ditambahkan ampisilin dengan volume yang lebih besar. Kultur diinkubasi pada
inkubator berpenggoyang dengan suhu 37 °C dan kecepatan 150 rpm hingga optical density OD
600
mencapai 0,3. Pada nilai tersebut diperkirakan kultur sudah memasuki fase awal logaritmik. Sezonov et al. 2007 menjelaskan bahwa
bakteri E. coli yang ditumbuhkan pada media LB memasuki fase pertumbuhan eksponensial pada saat nilai OD
600
sebesar 0,2 atau 0,3; dan mengakhiri fase tersebut ketika nilai OD
600
sebesar 0,6 hingga 1. Pembelahan sel E. coli yang mengekspresikan RNA helikase pada fase
logaritmik terjadi sangat cepat, sehingga diperlukan penambahan isopropil β-D-
thiogalaktopiranosidase IPTG yang akan menginduksi gen NS3 RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi berlebih. Utama et al. 2000 menjelaskan bahwa
ekspresi berlebih pada gen NS3 menyebabkan pembentukan enzim RNA helikase dalam jumlah yang lebih banyak dari fase logaritmik hingga fase awal stasioner.
Koleksi sel E. coli menggunakan sentrifugasi dilakukan setelah nilai OD
600
mencapai ±1 ±3 jam, yang menunjukkan bahwa kultur sudah memasuki fase awal stasioner. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah untuk menghindari
protein mengalami denaturasi. Sentrifugasi akan memisahkan E. coli dengan media LB. Bakteri E. coli akan mengendap sebagai pelet, dan disimpan pada suhu
-20 °C untuk menjaga stabilitas sel bakteri. Enzim RNA helikase HCV terekspresi secara intraseluler pada sel E.coli
BL21 DE3 pLysS, sehingga untuk memurnikannya harus dilakukan pemecahan dinding sel agar komponen intraseluler termasuk RNA helikase HCV dapat keluar
dari dalam sel E. coli. Pemecahan sel dilakukan dengan metode freeze-thaw dan sonikasi. Proses freeze-thaw dilakukan dengan mengkondisikan sel E. coli selama
±30 menit secara bergantian di suhu ruang dan suhu beku -20 °C sebanyak tiga kali ulangan. Hal ini dapat menyebabkan terjadinya pembentukan kristal es pada
sel E. coli, sehingga sel akan lebih mudah untuk dipecah. Pemecahan sel selanjutnya adalah dengan sonikasi. Pada tahap sonikasi, sel E. coli dilarutkan
dalam bufer B, dengan komponen penyusunnya yaitu Tween 20, NaCl dan Tris HCl.
Tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi
membran sel dengan bagian hidrofobik dari RNA helikase yang sebelumnya menempel pada lipid bipolar tersebut SIGMA-ALDRICH 2008. NaCl berperan
sebagai penghilang kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik
dengan RNA helikase Vanz et al. 2008, sedangkan Tris HCl berfungsi sebagai larutan penyangga.
Hasil pemecahan sel bakteri cell lysate diduga telah mengandung enzim RNA helikase HCV, sehingga harus dimurnikan menggunakan kromatografi
afinitas. Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Ni
2+
atau Co
2+
yang dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag tag protein dengan enam histidin yang terdapat pada ujung RNA helikase. Petty 1996 menjelaskan
bahwa histidin akan berikatan secara selektif ke logam Co
2+
resin TALON meskipun dalam resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya. BD Bioscience
Clontech 2003 menjelaskan bahwa resin TALON menggunakan tetradentate metal chelator untuk purifikasi protein rekombinan polyhistidine-tagged.
Chelator tersebut mengikat kuat logam elektropositif pada kantung elektronegatif yang ideal untuk pengikatan ion logam seperti kobalt. Kantung pengikatan
tersebut adalah sebuah struktur oktahedral yaitu 4 dari 6 situs logam kobalt berikatan dengan ligan resin TALON, sedangkan dua situs yang bebas akan
berikatan dengan 6xHis-tag. Tetradendate metal berarti tidak ada logam yang tidak berikatan selama purifikasi protein dalam berbagai kondisi. Pengikatan resin
TALON dengan 6xHis-tag dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar 12 Pengikatan resin TALON A dengan 6xHis-tag B BD Bioscience Clontech 2003.
Resin yang telah mengikat dengan protein target, dimurnikan kembali dengan pencucian dalam bufer B. Pencucian bertujuan untuk menghilangkan
protein non target. Pemisahan protein target dari ikatan resin dilakukan dengan penambahan imidazol yang terdapat dalam bufer elusi. BD Bioscience Clontech
2003 menjelaskan bahwa konsentrasi imidazol hingga lebih dari 200 mM menyebabkan protein yang memiliki residu His-tag terdisosiasi karena tidak
mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin.
Analisis kemurnian protein target menggunakan pengukuran bobot molekul dengan SDS-PAGE. Hasil pelisisan sel, pencucian dari hasil pengikatan dengan
resin TALON dan hasil elusi dengan imidazol dilihat kemurniannya berdasarkan ada atau tidaknya protein target pada masing-masing tahapan tersebut.
Elektroforesis dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8. Hal ini dikarenakan protein target enzim memiliki bobot molekul yang besar,
sehingga dibutuhkan gel akrilamid dengan konsentrasi rendah agar terjadi pemisahan pita protein yang optimal. Elektroforegram SDS-PAGE dapat dilihat
pada Gambar 13.
Gambar 13 Analisis SDS-PAGE pemurnian RNA helikase HCV. P: pelet sel, S: supernatan hasil lisis, IV: inner volume supernatan binding,
W1: pencucian pertama, W2: pencucian kedua, E1E2: RNA helikase HCV, M: marker protein.
Hasil SDS-PAGE menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa pada hasil elusi dengan imidazol, sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase
HCV telah berhasil dipurifikasi. Hal ini sesuai dengan hasil yang telah dilaporkan Utama et al.2000 yang menyatakan bahwa bobot molekul RNA helikase yang
dimiliki oleh virus hepatitis C adalah sebesar 54 kDa. Hasil pencucian binding resin TALON W1 dan W2 tidak menunjukkan terdapatnya pita protein, hal ini
dikarenakan yang terdapat pada tahap itu hanya buffer B. Jalur hasil pelisisan sel menunjukkan pita protein target yang dalam hal ini diduga adalah RNA helikase,
sehingga dapat dikatakan bahwa sebelumnya RNA helikase telah terekspresi pada sel bakteri.
4.2 Kultivasi Mikroalga BTM 11
Kategori