Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu kolom analitik dan kolom preparatif.
5 Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom analisis kualitatif dan menghitung kadarnya analisis kuantitatif. 6 Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan kromatogram. Untuk
HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
2.8 Uji Kolorimetri ATPase
Penentuan aktivitas penghambatan RNA helikase HCV menggunakan uji kolorimetri ATPase Utama et al. 2000. Pengujian ini mengukur besar
penghambatan terhadap RNA helikase pada salah satu aktivitas enzimatiknya, yaitu ATPase RNA-stimulated ATPase. Penghambatan terhadap aktivitas
ATPase, secara tidak langsung juga menghambat aktivitas RNA helikase secara keseluruhan, karena helikase membutuhkan energi yang dihasilkan dari hidrolisis
ATP untuk memisahkan untai ganda RNA Hairany 2010. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebasanorganik Pi yang
terbentuk dari hidrolisis ATP oleh RNA helikase. Fosfat bebas akan membentuk kompleks warna dengan amonium molibdat membentuk fosfomolibdat.
Fosfomolibdat akan bereaksi dengan enzim RNA helikase sehingga protein akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan
kembali protein yang mengendap sehingga tidak terjadi kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi fosfat bebas yang dihasilkan dari
hidrolisis ATP. Penghentian reaksi warna dengan penambahan Na-sitrat yang dapat mencegah pembentukan warna yang berlebih Chan et al. 1986.
16
3 METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga April 2012, dan bertempat di Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Laboratorium
Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor dan Laboratorium Analisis Kimia, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi,
PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekspresi dan pemurnian enzim RNA helikase meliputi bakteri Escherichia coli BL21 DE3 pLysS yang membawa gen
NS3 RNA helikase virus hepatitis C dalam plasmid pET 21b koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI, media Luria Bertani LB, akuades, ampisilin,
isopropil β-D-thiogalaktopiranosidase IPTG 0,3 M; bufer B Tris HCl 10 mM pH 8,5; NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25, resin TALON, dan bufer elusi
400 mM imidazola dalam bufer B. Bahan-bahan yang digunakan untuk menganalisis bobot molekul protein
RNA helikase meliputi akuabides; Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; akrilamid 30, sodium dedosil sulfat SDS 10, TEMED, amonium persulfat APS 10,
comassie blue, dan loading dye. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan pemurnian polisakarida
dari mikroalga BTM 11 adalah isolat BTM 11 koleksi Dwi Susilaningsih, Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI,
trichloroacetic acid TCA, etanol, metanol, tris HCl 10 mM pH 8, glukosa 1 mgmL, fenol, asam sulfat, sepharose 4B, media IMK-Seawater; adenosin
trifosfat ATP 0,1 mM; 4-asam morfolinopropana sulfonat MOPS 0,1 mM; MgCl
2
1 mM, larutan hijau malakit, polivinil alkohol 2,3; amonium molibdat, natrium sitrat, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ultrasentrifus Sorvall RC-26 plus, sonikator, waterbath, tabung sentrifus, erlenmeyer, inkubator, rotator,
microtiter plate, microplate reader Multiscan EX Thermo, pipet mikro, oven,
kolom kromatografi, SDS-PAGE, tabung vial, hot plate magnetic stirer, dan timbangan digital.
3.3 Metode Penelitian
