Kromatografi cair kinerja tinggi

Selanjutnya dibuat pula sebuah garis akhir menggunakan pensil. Jarak antara garis awal dengan garis akhir biasanya 5 cm. Plat yang telah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam bejana pengembang yang telah terdapat eluen hasil proses penjenuhan yang dilakukan selama 20 menit. Penjenuhan berfungsi agar eluen lebih efektif dalam memisahkan komponen tersebut. Eluen akan memisahkan komponen hingga garis akhir yang telah didesain. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut Wilson Walker 1994. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 9. Gambar 9 Kromatografi lapis tipis Tissue 1996. Tahapan selanjutnya adalah visualisasi atau deteksi. Deteksi atau visualisasi sampel yang tidak berwarna dapat menggunakan dua cara, yaitu penyinaran dengan sinar UV 254 nm dan 356 nm dan pereaksi kimia ninhidrin, FeSO 4 , Dragendroff, dan anilin. Pada saat disinari dengan sinar UV, komponen yang terpisahkan akan terlihat seperti spot atau bidang kecil yang berwarna gelap. Deteksi komponen juga dapat dilakukan dengan menempatkan kromatogram pada bejana tertutup yang telah dijenuhkan dengan kristal iod. Uap kristal iod bereaksi dengan komponen yang terpisahkan dan terlihat seperti bercak-bercak kecoklatan. Aplikasi dari teknik ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif membandingkan retardation factor R f senyawa murni dengan komponen, pola sidik jari, dan menentukan jumlah komponen dan preparatif untuk memperoleh senyawa murni. Nilai R f yang akan dihasilkan dari suatu senyawa bernilai sama meskipun jarak plat yang digunakan berbeda Wilson Walker 1994.

2.7.4 Kromatografi cair kinerja tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography HPLC merupakan suatu metode yang sensitif dan akurat untuk penentuan kuantitatif serta baik untuk pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap. Pemisahan dengan HPLC mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode konvensional seperti waktu analisis yang cepat, biaya yang rendah dan kemungkinan untuk menganalisis sampel yang tidak stabil Nurhamidah 2005. Komponen penyusun HPLC secara skematik dapat dilihat pada Gambar 9. Gambar 10 Skematik komponen HPLC LC Resources Inc. 2001 Mardiana dan Ramdani 2008 menjelaskan komponen HPLC yang terdiri dari : 1 Tandon Reservoir Reservoir terbuat dari gelas atau stainless stell. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degassing system yang berfungsi untuk menghilangkan gas-gas yang terlarut dalam solven. Gas terlarut tersebut antara lain adalah oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil. 2 Pompa Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak solvent ke dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. 3 Katup injektor Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom. 4 Kolom Kolom merupakan jantung kromatografi. Berhasil atau tidaknya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu kolom analitik dan kolom preparatif. 5 Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom analisis kualitatif dan menghitung kadarnya analisis kuantitatif. 6 Recorder Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan kromatogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.

2.8 Uji Kolorimetri ATPase