a. Fase Gerak : H
2
SO
4
0,008 N b. Kolom
: Aminex® HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm c. Detektor
: Refractive Index d. Flow rate
: 1 mLmin e. Suhu kolom
: 35 ºC f. Back Pressure
: 1553 psi
3.4 Prosedur Analisis
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi 1 penentuan bobot molekul RNA helikase murni menggunakan SDS-PAGE, 2 uji aktivitas
penghambatan RNA helikase HCV terhadap ekstrak polisakarida dan fraksi polisakarida termurnikan, 3 penentuan kandungan gula pada fraksi polisakarida
murni yang memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap RNA helikase HCV.
3.4.1 Analisis enzim RNA helikase dengan SDS-PAGE Speicher 1997
Analisis menggunakan alat SDS-PAGE. Glass plate sandwich short plate spacer plate dibersihkan dengan etanol. Short plate ditempatkan di depan kaca
spacer plate. Kedua kaca kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan posisi bagian bawah kedua kaca sama rata lalu dikunci dengan menekan cams.
Casting frame dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel separating dibuat sesuai dengan prosedur Lampiran 2a. Larutan tersebut
dimasukkan di antara celah short plate spacer plate sampai duapertiga bagian lalu ditambah akuades sampai dengan batas atas kaca, ditunggu ±20 menit sampai
terbentuk gel. Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan prosedur Lampiran 2b. Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, air
yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukan, ditunggu ±20 menit sampai gel terbentuk.
Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada casting frame.Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan
posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber
dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution Buffer Elektroforesis SDS 1X pH 8,3.
Masing-masing sampel diambil 4 µ L lalu dicampur dengan 2 µ L loading dye Lampiran 2c. Campuran didenaturasi pada suhu 95 °C selama 15 menit.
Marker protein BIORAD
®
sebanyak 4 µ Lgel dimasukkan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur dengan loading dye, dimasukkan ke
dalam well sebanyak 5 µ Lwell.Gel dielektroforesis selama 90 menit dengan arus 40 mA. Gel diangkat lalu direndam dalam Commasie Blue G-250 staining
solution Lampiran 2d selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-250 destaining solution Lampiran 2e ±20
menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H
2
O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4 °C.
Gel menunjukkan elektroforegram dari RNA helikase HCV berupa pita protein dengan bobot molekul 54 kDa. Perhitungan bobot molekul BM
dilakukan terlebih dahulu dengan menghitung retardation factor R
f
dari masing- masing pita protein marker dan pita protein target menggunakan rumus :
Nilai R
f
pada pita-pita protein marker digunakan untuk memperoleh kurva standar terhadap log standar BM dari marker. Bobot molekul dihitung melalui
persamaan regresi linier kurva standar yang diperoleh, yaitu y = ax + b. Nilai “x” yang dimasukkan merupakan nilai R
f
dari pita protein target, sedangkan nilai “y” merupakan nilai log BM dari pita protein target. Nilai bobot molekul diperoleh
dari antilog BM pita protein target.
3.4.2 Uji aktivitas ATPase RNA helikase HCV Utama et al. 2000
