3.2.10 Pembuatan Ekstrak Kasar Enzim Lipase
Dipipet sebanyak 10 mL media hasil penanaman berdasarkan masing-masing konsentrasi induser dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian
disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit; didekantasi supernatan yang terbentuk. Dan diuji kadar protein dan aktivitasnya.
3.3 Parameter yang Diamati 3.3.1 Penentuan absorbansi maksimum larutan Bovine Serum Albumin
5000µgmL
Dipipet 1 mL larutan larutan BSA 5000 µgmL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 730 – 780 nm untuk menetukan panjang gelombang dengan absorbansi maksimum. Grafik hasil absorbansi
dapat dilihat pada hasil penelitian halaman 36-37
3.3.2 Penentuan Kurva standard larutan Bovine Serum Albumin
Dipipet 1 mL larutan larutan dari masing-masing larutan BSA dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µgmL dan masing-masing
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dtambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya
ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 775 nm kemudian
dibuat kurva standarnya.
3.3.3 Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Pseudomonas Aeruginosa
Dipipet 1 mL larutan enzim dari masing-masing supernatant tiap-tiap perlakuan dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL
pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan
dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang
Universitas Sumatera Utara
775 nm. Dihitung kadar protein dengan menggunakan kurva standar Boyer, 1993.
3.3.4 Penentuan kadar Asam Lemak Bebas
Ditimbang sampel minyak wijen seberat 2,5 g, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim lipase dan ditambahkan
25 mL Alkohol 96, ditutup dengan plastic dan karet dan dipanaskan hingga mendidih kemudian didinginkan. Ditambahkan 3 tetes indicator Penolftalein.
Kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,001 N hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi merah rose dan dicatat volume KOH 0,001 N yang
terpakai.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Skema Penelitian
3.4.1 Skema Pembuatan Media 3.4.1.1 Skema Pembuatan Media Tripton
Dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer 250 mL Ditambahkan 100 mL air laut
Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih Didinginkan
Ditutup dengan kapas dan alumunium foil Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit.
4 g Tripton Soya Agar
s
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.1.2 Skema Pembuatan Media Cair
Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL Ditambahkan 0,1 g MgSO
4
.7H
2
O
s
Ditambahkan 4,1698 g KH
2
PO
4 s
Ditambahkan 3,3652 g K
2
HPO
4 s
Ditambahkan 500 mL akuades Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat
Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit
3.4.1.3 Skema Pembuatan Media Cair dengan penambahan Kofaktor enzim Ca
2+
Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL Ditambahkan 7,5 g CaCl
2
.2H
2
O
s,
Ditambahkan 0,1 g MgSO
4
.7H
2
O
s
Ditambahkan 4,1698 g KH
2
PO
4 s
Ditambahkan 3,3652 g K
2
HPO
4 s
Ditambahkan 500 mL akuades Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat
Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit.
1,5 g NH
4
NO
3 s
Hasil 1,5 g NH
4
NO
3 s
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Skema Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa
Disterilkan didalam autoklaf Dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak ¼
volume cawan Diinokulasi biakan murni bakteri Pseudomonas
Aeruginosa ke dalam media tripton. Ditutup dengan alumunium foil dan klem-bab
lalu dibalut kertas Diinkubasi dalam inkobator pada suhu 35
o
C selama 4-5 hari
Media Triptonl
l
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Skema Penanaman media untuk menghasilkan ekstrak kasar enzim 3.4.3.1 Skema Penanaman bakter pada media cair
Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL
Ditambahkan induser minyak wijen dengan variasi 2, 4, 6, 8, 10.
Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab Dishaker dengan kecepatan 150 rpm
pada suhu 25
o
C selama 72 jam
Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit
Didekantasi supernatan yang terbentuk.
Dibagi dua
Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan
Dengan menggunakan penentuan kadar Asam
Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas
Media cair
l
Larutan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa
l
Ekstrak kasar Enzim Lipase
Campuran Ekstrak dan Media
Hasil 1 mL Ekstrak
kasar enzim Larutan Media bakteri
1 mL Ekstrak kasar enzim
Endapan sel bakteri
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.2 Skema Penanaman bakteri pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca
2+
Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL
Ditambahkan induser minyak wijen dengan variasi 2, 4, 6, 8, 10.
Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab Dishaker dengan kecepatan 150 rpm
pada suhu 25
o
C selama 72 jam
Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit
Didekantasi supernatan yang terbentuk.
Dibagi dua
Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan
Dengan menggunakan penentuan kadar Asam
Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas
Media cair dengan kofaktor enzim
2+
Larutan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa
l
Ekstrak kasar Enzim Lipase
Campuran Ekstrak dan Media
Hasil 1 mL Ekstrak
kasar enzim Larutan Media bakteri
1 mL Ekstrak kasar enzim
Endapan sel bakteri
Hasil
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Skema Parameter yang diamati 3.4.4.1 Skema Penentuan absorbansi maksimum larutan BSA 5000µgmL
Kategori