Kromatografi Kromatografi Lapis Tipis

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA akan dihasilkan ekstrak yang dapat berbentuk padatan atau cairan Nugroho, et al., 1999. Kelebihan dari alat ini adalah diperolehnya kembali pelarut yang diuapkan. Penggunaan vacuum rotary evaporator meningkatkan presentase plarut yang terevaporasi dibandingkan dengan menggunakan waterbath Mutairi Jasser, 2012. Prinsip kerja alat ini didasarkan pada titik didih pelarut dan adanya tekanan yang menyebabkan uap dari pelarut terkumpul, serta adanya kondensor yang menyebabkan uap ini mengembun dan akhirnya jatuh ke tabung penerima receiver flask.

2.9 Metode Isolasi

Suatu ekstrak yang telah dihasilkan dari suatu protokol ekstraksi yang sesuai dan pengujian aktivitas biologis telah dilakukan contohnya aktivitas antibakteri, langkah selanjutnya adalah fraksinasi ekstrak menggunakan metode pemisahan sehingga komponen biologis aktif dapat diisolasi Heinrich, et al., 2004. Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari keempat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah: kromatografi kertas KKt, kromatografi lapis tipis KLT. Kromatografi gas cair KGC, dan kromatografi cair kinerja tinggi KCKT Harborne, 1987.

2.9.1 Kromatografi

Kromatografi merupakan metode pemisahan fisikokimia untuk memisahkan campuran senyawa berdasarkan perbedaan waktu huni komponen campuran dalam sistem fase diam dan fase gerak Hostettman, et al., 1995. Prinsip pemisahan dari kromatografi adanya distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam stationer dan fase gerak mobile. Menurut Adrianingsih, 2009, persyaratan utama kromatografi antara lain: 1. Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak. UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2. Komponen sampel harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam. 3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus terikat kuat di posisinya.

2.9.2 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis KLT merupakan salah satu metode pilihan kromatografi secara fisikokimia Gandjar Rohman, 2007. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam uniform pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini merupakan bentuk terbuka dari kromatografi kolom Gritter, et al., 1991. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom Gritter, et al., 1991. Kromatografi lapis tipis KLT dapat digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik dalam jumlah kecil, misalnya menentukan jumlah komponen dalam campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya Townshend, 1995. Plat KLT yang umum digunakan adalah plat KLT analitik dengan ketebalan 0,1-0,2 mm dengan ukuran 20x20 cm yang dilapisi dengan adsorben silika gel 60 F 254 dengan ketebalan 0,2 mm. Plat kemudian ditempatkan ke dalam bejana dengan fase gerak yang sesuai, dimana ketinggian fase gerak cukup untuk membasahi bagian bawah plat dan tidak sampai membasahi dimana sampel diaplikasikan. Fase gerak kemudian bermigrasi melewati adsorben dengan gaya kaliper, dan proses ini dikenal sebagai pengembangan Sarker, et al., 2006. UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA KLT merupakan teknik yang benar-benar menguntungkan karena tingkat sensitivitasnya sangat besar dengan jumlah sampel lebih sedikit Brain Turner, 1975. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau cairan pengelusi, akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik ascending, atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun descending Gritter, et al., 1991. Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak Gandjar Rohman, 2007. Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai retardation farctor Rf. Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak Gandjar Rohman, 2007. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh, dan tidak bereaksi dengan penjerap Gritter, et al., 1991. Adsorben umumnya digunakan dalam KLT meliputi partikel silika gel ukuran 12 µm, alumina, mineral oksida, selulosa, poliamida, polimer penukar ion Gocan, 2002. a Silika Gel Silika gel adalah yang paling banyak digunakan sebagai adsorben dan fase stasioner yang dominan untuk KLT. Sebagian besar analisa dengan KLT dilakukan dengan menggunakan fase normal lapisan silika gel. Fase diam ini dapat digunakan sebagai fase polar maupun non polar. Untuk fase polar, merupakan silika yang dibebaskan dari air dan bersifat sedikit asam. Silika gel perlu ditambah gips kalsium sulfat untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung. Sebagai pendukung biasanya lapisan tipis digunakan kaca dengan ukuran 20x20 cm, 10x20 cm, atau 5x10 cm. Pendukung yang lain berupa lembaran alumunium atau plastik seperti ukuran di atas yang umumnya dibuat oleh pabrik. Silika gel kadang-kadang ditambah senyawa fluoresensi, agar bila disinari dengan sinar UV dapat berfluoresensi atau berpendar, sehingga UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA dikenal dengan silika gel 60 F 254 yang berarti silika gel dengan fluoresen yang berpendar pada panjang gelombang 254 nm. Silika gel untuk fase non polar terbuat dari silika yang dilapisi dengan senyawa non polar misalnya, lemak, parafin, minyak silikon, raber gom, atau lilin, dengan fase gerak air yang bersifat polar dapat digunakan sebagai eluen. Fase diam ini dapat memisahkan banyak senyawa namun elusinya sangat lambat dan keterulangannya kurang bagus Sumarno,2001. b Alumina Alumina merupakan adsorben yang paling banyak digunakan dalam KLT Gocan, 2002. Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih jarang digunakan. Saat akan digunakan harus diaktifkan kembali dengan pemanasan. Alumina yang digunakan sebagai fase diam untuk KLT umumnya yang bebas air, sehingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih tinggi Sumarno, 2001. c Perlit Mineral Perlit mineral adalah adsorben baru untuk KLT, yang dibuat dengan mengkonversi SiO 2 70-75 menjadi silikat yang larut dengan Na 2 CO 3 Gocan, 2002. d Kiselgur Fase diam ini sebenarnya merupakan asam silika yang berbentuk amorf, berasal dari kerangka diatomae, maka lebih dikenal dengan nama tanah diatomae, kurang bersifat adsorptif dibanding silika Sumarno, 2001. e Magnesium Silikat Fase diam ini hanya digunakan bila adsorben atau penjerap lain tidak dapat digunakan. Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan floresil Sumarno, 2001. Floresil magnesium silikat adalah endapan silika dan magnesium. Sifat dan aplikasi dari floresil pada KLT dan KCKT ditinjau dan dibandingkan dengan adsorben lainnya Gocan, 2002. UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA f Selulosa Polaritasnya tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pemisahan secara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk lempeng. Kedua bentuk tersebut masih sering digunakan untuk pemisahan flavonoid. Ukuran partikel yang digunakan kira- kira 50 m. Fase diam ini sekarang sudah diganti dengan bubuk selulosa yang dapat dilapiskan pada kaca seperti halnya fase diam yang lain sehingga lebih efisien dan lebih banyak digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa polar atau isomernya Sumarno, 2001. g Resin Fase diam resin digunakan pada KLT penukar ion. Resin merupakan polimer dari stirendivenil yang mengalami kopolimerisasi dan bersifat non polar. Fase diam ini sangat berguna untuk memisahkan senyawa berbobot molekul tinggi dan bersifat amfoter seperti asam amino, protein, enzim, nukleotida. Sebagai fase gerak digunakan larutan asam kuat atau basa kuat Sumarno, 2001.

2.9.3 Identifikasi Kromatogram