Kromatografi Lapis Tipis KLT Skrining Fitokimia Tiwari, et al., 2011; Fransworth, 1969

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA sehingga terhindar dari cahaya matahari. Selanjutnya dimasukkan pelarut n-heksana ke dalam wadah yang berisi serbuk simplisia hingga serbuk terendam ±3 cm di atas permukaan simplisia. Pelarut n-heksana yang digunakan untuk maserasi sebanyak 4,5 liter. Maserasi dilakukan selama 1-2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ampas yang tersisa, kembali ditambahkan n-heksana dan proses maserasi dilakukan kembali. Maserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana dilakukan sebanyak 15 kali hingga pelarut yang digunakan terlihat bening yang menandakan senyawa telah terekstraksi seluruhnya. Selanjutnya maserasi diganti dengan perlarut etil asetat, volume etil asetat yang digunakan sebanyak 4,5 liter. Prosedur ekstraksi sesuai dengan kegiatan ekstraksi sebelumnya. Maserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak 10 kali hingga pelarut yang digunakan terlihat bening. Total pelarut n-heksana yang digunakan untuk maserasi sebanyak 18 liter dan pelarut etil asetat yang digunakan sebanyak 10 liter.

3.3.4 Kromatografi Lapis Tipis KLT

Ekstrak yang diperoleh, dianalisa dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengamati pola pemisahannya. Lempeng KLT dengan ukuran 5x10 cm, pada bagian atas dan bawah plat, dibuat garis tepi sepanjang 1 cm. Selanjutnya dibuat sistem fase gerak yang terdiri dari n-heksana dan etil asetat dengan berbagai perbandingan, setiap perbandingan kepolarannya ditingkatkan 10. Fase gerak yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam bejana KLT dan dijenuhkan dengan memasukkan kertas saring ke dalamnya, hingga kertas saring terbasahi semua. Selanjutnya, 10 mg ekstrak dilarutkan dengan 1 mL pelarut etil asetat dan ditotolkan pada garis tepi bagian bawah plat dengan menggunakan pipa kapiler. Plat KLT dielusi di dalam masing-masing bejana KLT yang berisi fase gerak, hingga fase gerak mencapai garis tepi bagian atas, kemudian diangkat. Plat KLT dibiarkan kering dan dilihat pola pemisahannya secara langsung dan di UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Dari hasil KLT, dilihat kombinasi sistem fase gerak yang memberikan pola pemisahan yang baik.

3.3.5 Skrining Fitokimia Tiwari, et al., 2011; Fransworth, 1969

1 Uji Alkaloid Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam larutan HCl encer kemudian disaring dan filtrat dibagi menjadi dua tabung reaksi.  Tes Mayer: filtrat A ditambahkan reagen Meyer larutan kalium merkuri iodida. Terjadinya endapan berwarna putih mengindikasikan adanya senyawa alkaloid.  Tes Dragendorff: filtrat B ditambahkan reagen Dragendorff larutan kalium bismut iodida Terjadinya endapan berwarna merah bata mengindikasikan adanya senyawa alkaloid. 2 Uji Flavonoid Sejumlah Ekstrak dilarutkan dalam 5 mL air panas, didihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan serbuk Mg secukupnya, 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL etanol. Dikocok kuat dan dibiarkan terpisah. Terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan etanol menunjukkan adanya senyawa flavonoid. 3 Uji Saponin Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam 20 mL aquades, kemudian larutan dikocok dalam labu ukur selama 15 menit. Terbentuknya lapisan busa setinggi 1 cm mengindikasikan adanya senyawa saponin. 4 Uji Steroid dan Terpenoid  Tes Salkowski: Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform dan disaring. Kemudian filtrat ditambahkan beberapa tetes asam sulfat dan dikocok. Terbentuknya warna kuning emas mengindikasikan adanya senyawa tepenoid.  Tes Liberman Buchardat: Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform dan disaring, filtrat ditambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat, UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA kemudian dipanaskan dan didinginkan. Selanjutnya larutan ditambahkan beberapa tetes asam sulfat. Terbentuknya cincin coklat mengindikasikan adanya senyawa steroid. 5 Uji Fenol Sejumlah ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl 3 . Terbentuknya warna biru kehitaman mengindikasikan adanya senyawa fenol. 6 Uji Tanin Tes gelatin: Sejumlah ekstrak ditambahkan larutan gelatin yang mengandung natrium hidroksida. Terbentuknya endapan putih mengindikasikan adanya senyawa tanin. 7 Uji Asam Lemak Sejumlah ekstrak dicampur dengan 5 ml eter, kemudian diuapkan. Ekstrak yang telah diuapkan ditotolkan di atas kertas saring dan dibiarkan kering. Bercak transparan pada kertas saring setelah ditotolkan ekstrak mengindikasikan adanya senyawa asam lemak. 8 Uji Kumarin Sejumlah ekstrak ditambahkan 1 mL NaOH 5 N dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan selama beberapa menit di atas penangas air. Selanjutnya larutan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh dilihat di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Terjadinya fluoresensi dengan warna kuning kehijauan mengindikasikan adanya senyawa kumarin.

3.3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH