UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
kemudian dipanaskan
dan didinginkan.
Selanjutnya larutan
ditambahkan beberapa tetes asam sulfat. Terbentuknya cincin coklat mengindikasikan adanya senyawa steroid.
5 Uji Fenol
Sejumlah ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl
3
. Terbentuknya warna biru kehitaman mengindikasikan adanya senyawa fenol.
6 Uji Tanin
Tes gelatin: Sejumlah ekstrak ditambahkan larutan gelatin yang mengandung natrium hidroksida. Terbentuknya endapan putih mengindikasikan
adanya senyawa tanin.
7 Uji Asam Lemak
Sejumlah ekstrak dicampur dengan 5 ml eter, kemudian diuapkan. Ekstrak yang telah diuapkan ditotolkan di atas kertas saring dan dibiarkan kering. Bercak
transparan pada kertas saring setelah ditotolkan ekstrak mengindikasikan adanya senyawa asam lemak.
8 Uji Kumarin
Sejumlah ekstrak ditambahkan 1 mL NaOH 5 N dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan selama beberapa menit di atas penangas air. Selanjutnya
larutan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh dilihat di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Terjadinya
fluoresensi dengan warna kuning kehijauan mengindikasikan adanya senyawa kumarin.
3.3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH
Uji kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Larutan DPPH dengan konsentrasi 0,04 dalam 20 mL
metanol dibuat dengan cara menimbang 8 mg serbuk DPPH, kemudian dilarutkan dalam 20 mL metanol pro analisis. Ekstrak yang sebelumnya telah dilakuakan
pemisahan dengan KLT, disemprot dengan reagen tersebut hingga seluruh plat terbasahi. Plat yang telah disemprot dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
tertutup. Selanjutnya dilihat pola bercak yang memberikan aktivitas antioksidan
pada plat KLT Basma, et al., 2011. 3.3.7
Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dengan Kromatografi Kolom
Ekstrak etil asetat yang memiliki aktivitas antioksidan setelah diuji secara kualitatif dengan DPPH, selanjutnya difraksinasi dengan metode kromatografi
kolom. Kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 100 cm dan diameter 5 cm. Kolom disiapkan dengan menyumbat pada bagian dasarnya
dengan menggunakan kapas. Selanjutnya kolom dialiri dengan pelarut n-heksana dan kapas ditekan-tekan dengan batang pengaduk hingga tidak ada udara yang
terjerap. Dibuat bubur silika dengan menimbang serbuk silika gel sebanyak 250 gram
kemudian didispersikan dengan pelarut n-heksana hingga menjadi bubur suspensi. Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi dan Kolom dialiri
dengan menggunakan pelarut n-heksana. Pelarut yang menetes ditampung, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sambil diketuk-ketuk. Proses ini
dilakukan hingga silika gel mampat. Tahap selanjutnya, ekstrak etil asetat sebanyak 32 gram dipreadsorbsi dengan silika gel sebanyak 15 gram. Ekstrak
dimasukkan ke dalam kolom dan disumbat dengan kapas. Selanjutnya dibuat sistem fase gerak dengan komposisi n-heksana dan etil
asetat dengan berbagai perbandingan. Sistem fase gerak yang digunakan adalah sistem gradien, setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 10. Fraksinasi pertama
dilakukan dengan mengaliri kolom menggunakan fase gerak n-heksana 100 sebanyak 250 mL. Pelarut yang menetes, ditampung dalam vial yang sebelumnya
telah diberi nomor. Penggantian gradien fase gerak dilakukan ketika gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom.
Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Pada tahap akhir kromatografi kolom, kolom
dicuci dengan mengaliri pelarut metanol 100 sebanyak 300 mL untuk membersihkan silika gel dari sisa ekstrak yang masih menempel. Setiap fraksi
yang diperoleh, dilakukan kromatografi lapis tipis dan dilihat pola bercak yang dihasilkan dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Hasil KLT, dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan menyemprot reagen DPPH dengan konsentrasi 0,04. Fraksi yang memberikan pola bercak dengan nilai Rf
yang sama, digabungkan dalam satu vial yang selanjutnya akan difraksinasi kembali untuk melakukan pemisahan lebih lanjut. Fraksinasi dengan kroatografi
kolom dilakukan hingga diperoleh senyawa murni.
3.3.8 Pemurnian Kristal
