3.4 Analisis data
Analisis komposisi masing masing asam amino dalam sampel dapat dihitung dengan perhitungan :
Kadar asam amino dalam mg 100 gram Area komponen area AABAsampel x C
std
x BM x fp x 100 Area komponen area AABAstandar x 1000000 x gr x 1000
Dan untuk analisis komponen utama PCA dilakukan dengan perangkat lunak Minitab versi 15. Nilai persen tinggi puncak masing
masing asam amino adalah variabel variabel yang akan dimasukkan ke dalam analisis data statistik dengan PCA.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penyiapan sampel
Dalam penelitian ini sampel disiapkan dengan membuat marshmallow dari gelatin sapi standar dan gelatin babi standar.
Marshmallow dibuat dengan menambahkan sukrosa, air, glukosa, amilum dan penambahan flavour pandan. Marshmallow yang dihasilkan berwarna
hijau, kenyal, mempunyai rasa manis, dan meleleh di mulut saat dimakan. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Nemati et al, analisa kandungan
asam amino gelatin sapi dan gelatin babi dilakukan dengan High Performance Liquid Chromatography HPLC. Sebelum dilakukan
analisis asam amino menggunakan HPLC, sampel gelatin sapi standar, gelatin babi standar, dan sampel marshmallow dipersiapkan untuk
dipreparasi terlebih dahulu sebelum di injeksikan kedalam HPLC dengan cara menghidrolisis gelatin menjadi asam amino
– asam amino penyusunnya dan menderivatisasinya agar menghasilkan derivat yang
mampu berfluoresensi.
4.1.1 Hidrolisis gelatin
Hidrolisis dilakukan dengan menimbang sampel sebanyak 0,1 gram kemudian dimasukan ke dalam tabung bertutup ulir lalu dihidrolisis
menggunakan HCl 6N dengan konsentrasi 2, kemudian dialiri sedikit gas nitrogen untuk mencegah terjadinya oksidasi pada sampel setelah itu
dimasukkan ke dalam oven pada suhu 110 C selama 22 jam. Setelah
dihidrolisis campuran didinginkan pada suhu ruang. Kemudian isi tabung dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan aquabides
sampai tanda batas sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,2. Hasil dari proses hidrolisis akan menghasilkan asam amino dalam keadaan bebas.
Hasil hidrolisis menghasilkan larutan hitam kecoklatan, sehingga tidak bisa langsung di injeksikan kedalam HPLC. Sebelum dilakukan injeksi
kedalam alat HPLC hasil hidrolisis di filter terlebih dahulu dengan
menggunakan membran filter berpori 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dari komponen lain yang dapat mengganggu
proses pada saat analisis dan menghilangkan zat yang dapat merusak kolom HPLC. Setelah proses filtrasi menggunakan membran filter 0,45
µm, larutan akan terlihat bening dan bersih. Setelah itu dipipet 500 µl filtrat lalu ditambahkan 40 µl AABA
alpha aminobutyric acid dan 460 µl aquabides sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,1. Hidrolisis ini dilakukan untuk melepaskan asam
amino - asam amino yang terdapat dalam gelatin, yaitu melalui pemotongan ikatan peptida asam amino penyusun gelatin. Selama proses
hidrolisis ini, hubungan antara ikatan rantai polipeptida dari kolagen dengan ikatan rantai polipeptida yang lain akan menjadi terpisah. Hal ini
disebabkan karena rusaknya struktur fibrosa dari kolagen See et al., 2010.
Asam amino yang dilepaskan selanjutnya akan dianalisis berdasarkan profil asam amino gelatin yang akan menjadikan pedoman
dalam pembedaan sumber gelatin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh nemati et al., hidrolisis dilakukan dengan menggunakan
HCl karena HCl dapat memecah ikatan peptida secara sempurna Masuda dan Domae, 2011.
4.1.2 Derivatisasi asam amino
Derivatisasi asam amino dilakukan dengan menambahkan 70 µl AccQ fluor borat dan 20 µl reagen fluor A ke dalam 10 µl filtrat dengan
konsentrasi 0,01. Kemudian vortex dan diamkan selama 1 menit. Lalu inkubabasi pada suhu 55
C selama 10 menit dan disuntikan pada HPLC. Asam amino adalah senyawa yang secara umum tidak memiliki gugus
kromofor kecuali asam amino fenilalanin, tirosin dan triptofan. Oleh karena itu dalam penelitian ini perlu dilakukan proses derivatisasi asam
amino yang bertujuan agar menghasilkan derivat yang mampu berfluoresensi sehingga pengukuran menjadi lebih selektif dan sensitif
Rohman dan Sumantri, 2007.
Reaksi derivatisasi harus mempunyai beberapa persyaratan, diantaranya adalah: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik
sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri , proses
derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin dan produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan
deteksi Rohman dan Sumantri, 2007. Ada beberapa agen penderivat yang dapat digunakan untuk
menderivatisasi asam amino sebelum dilakukan analisis dengan HPLC, antara lain adalah NBD- F 7-fluoro -4-nitrobenzo diazole, aminokuinolil-
N-hidroksisuksini-midil karbamat AQC, FMOC- Cl 9-fluoronylmethyl- chloroformate dan o-ftalaldehid Masuda dan Domae, 2011. Agen
penderivat yang digunakan dalam penelitian ini adalah AQC aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat.
Pereaksi penderivat AQC ini telah disentesis dan telah digunakan secara sukses untuk pemisahan dan analisis kuantitatif asam amino dalam
hidrolisat protein, baik dengan menggunakan detektor fluoresen atau detektor UV. Derivatisasi dengan AQC ini sangat cepat hanya beberapa
detik dan sederhana. Lebih lanjut, produk yang dihasilkan stabil dan adanya kelebihan AQC tidak mengganggu proses pemisahan Rohman dan
Sumantri, 2007. AQC ini merupakan agen penderivat yang paling stabil jika dibandingkan dengan agen penderivat lainnya. Agen penderivat AQC
ini stabil selama 7 hari pada suhu ruang. Selain itu juga AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder
Masuda dan Domae, 2011 sehingga paling cocok digunakan dalam proses derivatisasi.
Gambar 3. Reaksi derivatisasi asam amino oleh AQC Hou,2009.