Analisis Asam Amino Asam amino

2.6.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT HPLC

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan cuplikan antara fase yang bergerak dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam dapat berupa zat cair atau zat padat. Kromatografi ini ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903 Johnson dan Stevenson, 1991. HPLC High Performance Liquid Chromatography merupakan metode pilihan untuk analisis asam asam amino karena merupakan metode yang serba guna, mempunyai kapasitas yang tinggi, dan dapat dipercaya. Karena kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel, maka asam asam amino tidak dapat dideteksi dengan menggunakan detektor spektrofotometer UV- Vis yang merupakan detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengembangkan prosedur prosedur derivatisasi yang membuat asam amino lebih mudah dideteksi. Suatu pereaksi penderivat harus mempunyai syarat syarat sebagai berikut : a Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri. b Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin. c Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi Abdul Rohman, 2007 . HPLC High Performance Liquid Chromatography merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri makanan Sudjadi, 2007. High Performance Liquid Chromatography adalah jenis yang khusus dari kromatografi kolom. Metode ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase gerak Gottfried, 1988. HPLC High Performance Liquid Chromatography paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa senyawa tertentu seperti asam asam amino,asam asam nukleat,protein protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa aktif obat, proses hasil samping proses sintetis, memonitor sampel sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan suatu senyawa dalam suatu campuran Sudjadi, 2007. Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut solut ini diatur oleh distribusi solut oleh fase gerak dan fase diam. Fase gerak haruslah mempunyai sifat yang murni, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dan harganya cukup terjangkau. Johnson dan Stevenson, 1991. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam.