7. Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing konsentrasi larutan seri baku asam askorbat 40; 50; dan 60 µgmL dengan pelarut fase gerak, discan antara panjang gelombang 200-400
nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan untuk deteksi
pada sistem KCKT yaitu panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimum dari ketiga konsentrasi tersebut.
8. Preparasi larutan sampel
Sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” yang mengandung 200 mgmL asam askorbat klaim label, diambil sejumlah 50 µL dan dimasukkan
ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan fase gerak sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan stok sampel yang memiliki konsentrasi asam askorbat
1000 µgmL. Kemudian diambil sejumlah 2,0 mL larutan stok sampel dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan fase gerak sampai
tanda batas sehingga diperoleh larutan sampel yang memiliki konsentrasi asam askorbat 100 µgmL. Larutan sampel disaring dengan menggunakan milipore dan
didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit.
9. Optimasi pemisahan asam askorbat dari matriks sampel dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik
a. Optimasi komposisi fase gerak. Larutan kerja asam askorbat dengan konsentrasi 100 µgmL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT.
Optimasi dilakukan pada panjang gelombang maksimum dengan
menggunakan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; dan 50 : 50 pada
kecepatan alir fase gerak 1,0 mLmenit. Dilakukan analisis hasil terhadap parameter nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak
terdekat senyawa lain, waktu retensi dan nilai tailing factor dari berbagai perbandingan fase gerak.
b. Optimasi kecepatan alir fase gerak. Larutan kerja asam askorbat dengan konsentrasi 100 µgmL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT.
Optimasi dilakukan pada panjang gelombang maksimum dengan menggunakan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan
perbandingan hasil optimasi pada kecepatan alir fase gerak 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; dan 1,2 mLmenit. Dilakukan analisis hasil terhadap parameter
nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi dan nilai tailing factor dari berbagai
kecepatan alir fase gerak. c. Pemisahan asam askorbat dari matriks larutan sampel dengan fase gerak
hasil optimasi. Larutan sampel dengan konsentrasi 100 µgmL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT. Pengamatan dilakukan
menggunakan komposisi dan kecepatan alir fase gerak hasil optimasi serta pada panjang gelombang maksimum yang telah ditentukan.
Kromatogram yang dihasilkan diamati dan dihitung parameter uji kesesuaian sistem yang meliputi nilai resolusi antara puncak asam
askorbat dengan puncak senyawa lain, luas puncak asam askorbat, nilai
N dan HETP dari pemisahan asam askorbat dari matriks pada larutan sampel.
d. Uji kesesuaian sistem KCKT. Larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 100 µgmL diinjeksikan sebanyak 20 µL ke sistem KCKT
menggunakan fase gerak dan kecepatan alir fase gerak hasil optimasi. Penginjekan larutan ini dilakukan sebanyak 6 kali. Pengamatan dilakukan
pada panjang gelombang maksimum dan kemudian diamati kromatogram asam askorbat hasil pemisahan dan dihitung nilai resolusi antara puncak
asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi, nilai k’, nilai tailing factor, area under curve AUC, tinggi puncak, nilai N
dan HETP, serta koefisien variansi pada masing-masing parameter tersebut.
G. Analisis Hasil
Kategori