gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 yang akan di optimasi yaitu 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60 dan 50 : 50. Asam askorbat merupakan senyawa yang
bersifat polar sehingga cenderung akan lebih optimal terelusi dengan menggunakan fase gerak yang bersifat polar dalam sistem KCKT fase terbalik.
Fase gerak yang telah dipersiapkan, disaring dengan menggunakan kertas Whatman 0,45 µm dengan maksud untuk menghilangkan partikel-partikel
yang dapat mengotori kolom dan mengganggu pengukuran. Selanjutnya, fase gerak harus didegassing selama kurang lebih 15 menit untuk menghilangkan
gelembung gas yang dapat mengganggu detektor.
C. Larutan Baku
Baku asam askorbat yang digunakan adalah reference standard dengan kemurnian 98,7 yang didapatkan dari PT. Supelco dan memiliki Certificate of
Analysis CoA yang dapat dilihat pada lampiran 1 sehingga terjamin kemurniannya. Tujuan pembuatan larutan baku adalah memastikan di dalam
sampel terdapat zat asam askorbat yang hendak dianalisis. Tujuan tersebut dilihat dari kesamaan waktu retensi antara waktu retensi larutan baku dengan senyawa
analit dalam sampel. Pada penentuan panjang gelombang maksimum dibuat larutan baku
dengan tiga level konsentrasi berbeda, yaitu 40, 50, dan 60 µgmL pada pelarut campuran fase gerak. Larutan baku tersebut diukur absorbansi pada panjang
gelombang UV antara 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis.
Optimasi sistem KCKT dilakukan dengan menggunakan larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 100 µgmL. Tujuan dibuat larutan baku asam
askorbat adalah untuk mengetahui waktu retensi asam askorbat. Larutan baku ini akan digunakan dalam optimasi komposisi fase gerak dan kecepatan alir sistem
KCKT. Uji kesesuaian sistem KCKT menggunakan larutan baku asam askorbat
dengan konsentrasi 100 µgmL juga. Uji kesesuaian sistem dilakukan pada kondisi sistem KCKT dengan komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang
optimal. Larutan baku yang sudah dibuat perlu disaring terlebih dahulu dengan
milipore dengan tujuan untuk menghilangkan partikel yang dapat menyumbat kolom dan mengkontaminasi fase diam. Setelah dilakukan penyaringan, larutan
baku juga perlu didegassing sebelum diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan tujuan untuk menghilangkan gelembung gas yang bisa mengganggu respon
detektor.
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Askorbat Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis
Panjang gelombang yang digunakan untuk pengamatan pada instrumen KCKT fase terbalik ditentukan dengan mengukur panjang gelombang analit
tunggal terlebih dahulu menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Secara teori, asam askorbat memiliki rentang panjang gelombang di daerah UV yaitu antara
200-400 nm. Asam askorbat diukur pada tiga seri konsentrasi yaitu 40, 50, dan
60 µgmL. Pembuatan tiga seri konsentrasi dilakukan dengan maksud untuk melihat kenaikan respon absorbansi terhadap kenaikan konsentrasi sehingga kita
dapat memastikan bahwa bentuk spektra serta panjang gelombang maksimum yang diperoleh adalah benar-benar milik asam askorbat.
Gugus kromofor dan auksokrom pada asam askorbat dapat dilihat pada Gambar 10 di bawah ini:
Gambar 10. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat
Pola spektrum asam askorbat pada konsentrasi 40, 50, dan 60 µgmL menunjukkan bahwa kenaikan respon absorbansi sebanding dengan kenaikan
konsentrasi dan dapat dilihat pada Gambar 11 di bawah ini:
Gambar 11. Spektra asam askorbat pada seri konsentrasi 40, 50 dan 60 µgmL dengan pelarut campuran fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3
Hasil spektra asam askorbat pada tiga seri konsentrasi menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum asam askorbat adalah 244 nm. Menurut
Moffat dkk. 2011, panjang gelombang maksimum asam askorbat adalah 243 nm. Menurut Farmakope Indonesia edisi IV 1995, pergeseran panjang
gelombang yang diijinkan adalah sebanyak 1 nm. Hasil pengukuran yang dilakukan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang bergeser 1 nm dari
teoritis, sehingga panjang gelombang maksimum yang diperoleh dari hasil pengamatan dapat diterima dan digunakan untuk pengukuran dengan sistem
KCKT fase terbalik.
E. Optimasi Komposisi Fase Gerak
