Pemisahan yang baik adalah pemisahan yang menghasilkan bentuk puncak simetris, waktu retensi 10 menit, memiliki nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap
puncak terdekat, dan nilai koefisien variansi CV ≤ 2 Snyder dkk., 2010.
1. Bentuk puncak pemisahan asam askorbat
Bentuk puncak yang diharapkan adalah simetris. Parameternya adalah asymmetry factor A
s
dan tailing factor T
f
. Nilai asymmetry factior A
s
dihitung pada 10 tinggi puncak dan nilai tailing factor T
f
dihitung pada 5 tinggi puncak. Perhitungan A
s
dan T
f
dapat dilakukan dengan persamaan yang tercantum pada Gambar 6.
Apabila nilai A
s
dan T
f
= 1, maka dapat dikatakan puncak yang dihasilkan simetris. Akan tetapi, pada nilai A
s
dan T
f
2 puncak juga masih dikatakan baik Snyder dkk., 2010.
2. Waktu retensi t
R
Pengamatan waktu retensi dilakukan untuk melihat waktu yang dibutuhkan suatu senyawa berpisah dengan optimal dalam suatu campuran.
Apabila waktu yang didapatkan kurang dari 10 menit, maka dapat dikatakan waktu pemisahan efektif Snyder dkk., 2010.
3. Nilai resolusi R
s
Nilai resolusi pemisahan puncak dapat dihitung dengan persamaan berikut:
W 0,5W
t t
Rs
1 2
R1 R2
+ −
=
Dimana : t
R1
dan t
R2
= waktu retensi komponen W
1
dan W
2
= lebar alas puncak komponen
Pemisahan yang baik adalah pemisahan yang menghasilkan nilai resolusi sebesar ≥1,5 Rohman dan Gandjar, 2007.
4. Nilai HETP
Nilai HETP dapat dihitung melalui persamaan berikut:
N L
HETP =
Dimana : L = panjang kolom
N = jumlah lempeng
dimana nilai N merupakan bilangan lempeng teoritik dan dapat dihitung dengan persamaan berikut:
2 h
2 1
R
W t
x 5,54
N ⎟⎟
⎟ ⎠
⎞ ⎜⎜
⎜ ⎝
⎛ =
Dimana : tR = waktu retensi analit
h 2
1
W
= lebar puncak pada posisi setengah tinggi puncak
Apabila nilai HETP semakin kecil, maka efisiensi kolom akan semakin baik dan pemisahan juga semakin baik.
5. Nilai koefisien variansi
Nilai koefisien variansi resolusi, tailing factor, HETP, AUC dan waktu retensi asam askorbat hasil pemisahan diketahui dengan menghitung nilai CV
dengan menggunakan persamaan berikut:
x SD
CV =
Dimana : SD = standar deviasi data
x
= rata-rata jumlah data
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Pelarut
Pemilihan pelarut dalam analisis menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT menjadi penting karena analit harus terlarut dalam
pelarut sebelum masuk ke sistem KCKT. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam askorbat adalah campuran fase gerak metanol dan bufer fosfat
0,01 M yang dominan mengandung akua demineralisata. Asam askorbat dapat terlarut dalam akua demineralisata dan metanol. Kelarutan asam askorbat dalam
air pada suhu 20°C adalah 290 gL dan kelarutan dalam metanol adalah 125 gL International Œnological Codex, 2007. Syarat pemilihan pelarut adalah dapat
melarutkan analit dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit dan tidak toksik. Akua demineralisata merupakan jenis pelarut air yang bebas mineral. Proses
mendapatkan akua demineralisata adalah dengan melewatkan air mineral yang mengandung ion melalui suatu kolom resin sehingga mineral yang ada akan
tertahan pada kolom resin Falah dkk., 2009. Degradasi asam askorbat akan meningkat dengan adanya ion logam
transisi seperti Cu
2+
dan Fe
3+
. Menurut Khan dan Sarwar 1999, ion Cu
2+
, Fe
3+
, Cr
6+
, Mn
2+
dan V
5+
mampu meningkatkan kecepatan reaksi degradasi asam askorbat pada suhu ruang 25°C. Kandungan trace metal dalam akua
demineralisata sangat kecil Soen dkk., 1966 sehingga penggunaan akua demineralisata diharapkan dapat meminimalkan risiko degradasi asam askorbat
oleh trace metal.
