Tempat Pelaksanaan Alat dan Bahan Persiapan organ

28

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat Pelaksanaan

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April 2012 sampai Juli 2013 di Laboratorium Struktur Hewan, Departemen Biologi, dan Laboratorium Kimia Bahan Alam, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam pemeliharaan hewan percobaan adalah: kandang hewan, timbangan digital dan mencit Mus musculus L. jantan. Alat dan bahan yang digunakan untuk pembuatan ekstrak adalah : rotary evaporator, botol gelap, penangas air, etanol 96, karboksil metil selulosa CMC. Alat dan bahan yang digunakan untuk penginduksian mencit DM dan perlakuan adalah: aloksan jenis serbuk, ekstrak etanol biji mahoni Swietenia mahogani Jack., jarum gavage,. Alat yang digunakan untuk memeriksa kadar gula darah adalah : Glukometer EasyTouch ® GCU, EasyTouch ® blood glucose test strip. Alat dan bahan yang digunakan untuk pembuatan sediaan mikrostruktur adalah : bak bedah dan dissecting set, mikrotom, plat parafin, mikroskop cahaya, alkohol bertingkat, larutan Bouin, pewarna Hematoxylin dan Phloxine, Canada balsam, xylol, parafin.

3.3. Pemeliharaan Hewan Percobaan

Percobaan menggunakan mencit Mus Musculus L., jenis kelamin jantan yang sehat, umur mencit ± 3 bulan, belum pernah digunakan untuk percobaan lain dan mempunyai berat badan antara 25–35 g. Mencit percobaan diperoleh dari peternakan mencit enterpreneurship D tik pop, Medan. Mencit ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 30x20x10 cm yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal Universitas Sumatera Utara 29 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan dan air minum disuplai setiap hari secara berlebihan.

3.3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan lima perlakuan dan lima kali ulangan. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus : Pada rumus tersebut, jika adalah perlakuan dalam penelitian 5 kelompok perlakuan, dan adalah jumlah ulangan per kelompok, maka jumlah yang di harapkan teoriditis adalah 5 Fereder, 1963 dalam Fidzaro, 2010. Sehingga jumlah hewan uji untuk penelitian berjumlah 25 ekor. Kontrol yang digunakan adalah kontrol negatif dan kontrol hiperglikemia pemberian aloksan 180 mgkg bb dengan satu kali pemberian Etuk, 2010. Sedangkan perlakuan yang diberikan adalah dengan pemberian aloksan dan diberi ekstrak biji mahoni dengan dosis yang berbeda. Ekstrak etanol biji mahoni diberikan dengan dosis bertingkat, yaitu dengan dosis 1,4 mgkg bb dan 2,8 mgkg bb dan 4,2 mgbb secara oral dengan pencekokan sekali sehari selama 12 hari dengan volume pemberian 0,1 ml 10 g bb . Tabel 1. Rancangan Penelitian No Perlakuan Jumlah mencit Keterangan 1 Kontrol negatif 5 Diberi pakan dan minum tanpa ada perlakuan 2 Kontrol positif 5 Induksi aloksan 3 P1 5 Induksi aloksan 5,04 mg + ekstrak etanol biji mahoni dosis 1,4 mg 4 P2 5 Induksi aloksan 5,04 mg + ekstrak etanol biji mahoni dosis 2,8 mg 5 P3 5 Induksi aloksan 5,04 mg + ekstrak etanol biji mahoni dosis 4,2 mg Universitas Sumatera Utara 30 3.4. Pelaksanaan Penelitian 3.4.1. Persiapan dan pembuatan mencit DM Mencit dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok kontrol mencit normal tidak diabetes dan kelompok mencit diabetes. Tikus diinduksi diabetes aloksan sebanyak 180 mgkg BB Etuk, 2010. Berdasarkan angka konversi, maka untuk membuat diabetes pada mencit, diinduksi aloksan 5,04 mg yang dilarutkan dalam 1 ml NaCl dan diberikan secara intraperitoneal dengan satu kali pemberian. Sebelum pemberian aloksan mencit dipuasakan selama 16 jam dan sekam dikeluarkan dari kandang, agar tidak dimakan oleh mencit Rahim, 2008. Perlakuan fisiologis hiperglikemia, yaitu berdasarkan pemberian volume intraperitoneal sebanyak 1 ml Ritshel, 1974 dalam Sulastry, 2009

3.4.2. Pengambilan dan pengolahan ekstrak

3.4.2.1. Pengambilan ekstrak

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkannya dengan tumbuhan serupa dari daerah lain, sampel diambil dari hutan Tridharma Universitas Sumatera Utara. Sampel yang diambil adalah biji yang sudah tua yang telah jatuh dari pohonnya dan warna kulit biji hitam kecokelatan.

3.4.2.2. Pengolahan Ekstrak

Biji mahoni dibersihkan dari kulit yang membungkusnya, lalu ditimbang dan diperoleh berat basah, kemudian dikeringkan tidak pada sinar matahari langsung, biji dianggap kering apabila ditumbuk tidak menggumpal lagi, kemudian diblender hingga menjadi serbuk.

3.4.2.3 . Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 96, cara kerjanya sebagai berikut: 500 g serbuk biji kering mahoni yang diperoleh dimasukkan ke dalam wadah botol berwarna gelap, kemudian ditambahkan pelarut etanol 96 sebanyak 2 L. Ditutup dan dibiarkan selama dua hari terlindung dari cahaya sambil diaduk, disaring sehingga dapat maseratnya. Ampas dimaserasi dengan etanol 96 sebanyak 2 L menggunakan prosedur yang Universitas Sumatera Utara 31 sama, maserasi dilakukan sampai diperoleh maserat yang jernih. Semua maserat etanol digabungkan dan diuapkan dengan menggunakan alat vakum putar pada temperatur sekitar 40 o C sampai diperoleh ekstrak etanol kental kemudian dikeringkan menggunakan penangas air Maksum, 2008 dalam Lumban Raja, 2009.

3.4.2.4. Pembuatan suspensi ekstrak etanol biji mahoni 2

Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi akuades panas sebanyak 10 ml. Didiamkan 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, dan digerus hingga terbentuk gel. Kemudian ekstrak etanol biji mahoni 2 g digerus, dan ditambahkan gel CMC sedikit demi sedikit dan terus digerus hingga terbentuk suspensi. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Volumenya dicukupkan dengan akuades 100 ml Lumban Raja, 2009.

3.4.2.5. Pembuatan Preparat Sayatan Limpa

Pembuatan preparat limpa dilakukan dengan metode paraffin Suntoro, 1983 dan pewarnaan Gomori Robb, 1960, sebagai berikut:

a. Persiapan organ

Mencit Mus musculus L. didislokasi dan dibedah. Limpa diambil dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9. Limpa difiksasi selama 1 hari dengan larutan Bouin. Limpa dicuci dengan alkohol 70 dengan cara dishaker sampai jernih dan direndam selama 1 malam dengan alkohol 70 . Dehidrasi dilakukan dengan merendam limpa sambil dishaker dengan alkohol bertingkat yaitu dari alkohol 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96 dan 100 selama 1 jam dalam masing- masing konsentrasi. Clearing penjernihan dilakukan dengan merendam limpa ke dalam xylol dalam botol balsem selama 1 malam. Infiltrasi dilakukan dengan merendam limpa ke dalam xylol selama 1 jam kemudian dipindahkan ke dalam xylol yang baru yang berada di dalam oven pada suhu 56 C selama 1 jam. Direndam limpa dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56 C.

b. Embedding penanaman organ