Alat-Alat yang Digunakan Bahan-Bahan yang Digunakan Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Kitolod

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis ekstrak dengan kromatografi lapis tipis, isolasi alkaloida dengan metode pengocokan asam basa, uji kemurnian isolat dan karakterisasi isolat dengan spektrofotometri ultraviolet dan spektrofotometri inframerah.

3.1. Alat-Alat yang Digunakan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, cawan penguap, spatula, blender Panasonic, eksikator, seperangkat alat destilasi, chamber, plat KLT dan plat kaca KLT preparatif, pipet kapiler, spray kromatografi, oven listrik Stork, tanur, krus porselen, penjepit tabung, kertas saring bebas abu, labu bersumbat, hair dryer Maspion, neraca analitik Vibra AJ, neraca kasar Saherand, penangas air Yenaco, rotary evaporator Boeci 461, lemari pengering, mikroskop Olympus, penjepit tabung, objek glass, deck glass, lampu spiritus, tisu lensa, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu dan spektrofometer IR IR- Prestige 21.

3.2. Bahan-Bahan yang Digunakan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah, sebagai sampel digunakan daun kitolod Hippobroma longiflora L. G. Don. Semua bahan yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah yang berkualitas proanalisa yaitu n- heksana, etilasetat, etanol, amil alkohol, benzen, toluen, metanol, kloroform, diklorometan, α-naftol, besi III klorida, iodium, raksa II klorida, kloralhidrat, 29 timbal II asetat, kalium iodida, asam sulfat pekat, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, bismut III nitrat, serbuk magnesium, amonia, kalium bromida, kloralhidrat, dan floroglusin HCI, air suling,

3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi

3.3.1 Pereaksi mayer

Sebanyak 1,359 gram raksa II klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Wadah lain kalium iodida ditimbang sebanyak 5 gram, dilarutkan dalam 10 ml air suling, kemudian keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.2 Pereaksi bouchardat

Sebanyak 4 gram kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling dan sebanyak 2 gram iodium ditimbang, dilarutkan dalam larutan kalium iodida dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.3 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 0,6 gram bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 2 ml asam klorida pekat, lalu ditambahkan 10 ml air suling. Wadah lain dilarutkan 6 gram kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dengan 7 ml asam klorida pekat dan 15 ml air suling Harborne, 1987.

3.3.4 Pereaksi Liebermann-Burchard

Dua puluh bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan satu bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.

3.3.5 Pereaksi asam klorida 2N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1995. 30

3.3.6 Pereaksi natrium hidroksida 2N

Sebanyak 8,002 gram kristal natrium hidroksida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 ml.

3.3.7 Pereaksi asam sulfat 2N

Sebanyak 9,808 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml Depkes RI, 1995. 3.3.8 Pereaksi Molish Sebanyak 3 gram α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.9 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 gram besi III klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat ditimbang, dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida sehingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.11 Larutan pereaksi kloralhidrat 70 bb

Sebanyak 70 gram kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 30 ml air suling Depkes RI, 1995.

3.4 Pengambilan dan Pengolahan Tumbuhan

3.4.1 Pengambilan tumbuhan

Sampel daun yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang dewasa yang tidak terlalu tua dari kitolod Hippobroma longiflora L. G. Don yang diambil dari Jalan KH. Hasanuddin Kecamatan Binjai Selatan, Provinsi Sumatera Utara. Pengambilan tumbuhan dilakukan secara purposif tanpa membandingkan 31 dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain dengan asumsi bahwa semua tumbuhan kitolod sama dan seragam secara genetika karena termasuk satu spesies yakni Hippobroma longiflora L. G. Don.

3.4.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 54.

3.4.3 Pembuatan simplisia

Daun kitolod segar 2,3 kg dibersihkan dari pengotor, kemudian dicuci dengan air mengalir hingga bersih, ditiriskan, lalu ditimbang 3,3 kg, lalu dikeringkan di lemari pengering dengan suhu ±50 C selama 5 hari. Tumbuhan dianggap kering apabila diremas akan hancur, lalu ditimbang 580 g, selanjutnya tumbuhan diserbukkan dengan menggunakan blender, ditimbang 450 g,dan disimpan dalam wadah tertutup rapat yang terlindung dari sinar matahari.

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi dari pemeriksaan makroskopik simplisia, pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut air, penetapan kadar sari yang larut etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam Depkes RI, 1995.

3.5.1 Pemeriksaan makroskopik simplisia dan serbuk

Pemeriksaan makroskopik simplisia dilakukan dengan mengamati dari bentuk, ukuran, bau, warna, karakteristik permukaan dan tekstur dari simplisia. Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman dan halaman 58 dan 59. 32

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun kitolod. Caranya: Sedikit serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesidengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 60 .

3.5.3 Penetapan kadar air

Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Saat toluen mendidih kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi setelah terdestilasi bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar, setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut air

Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan 33 sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.5.5 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95 menggunakan labu bersumbat sambil berkali- kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring dengan cepat untuk menghindarkan penguapan dari etanol, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.5.6 Penetapan kadar abu

Sebanyak 2 gram serbuk yang telah dihaluskan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselen yang telah terlebih dahulu dipijar dan ditara, kemudian diratakan, lalu krus dipijarkan perlahan-lahan sampai bobot tetap. Kadar abu dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, lalu disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas. 34 Residu dan kertas saring dipijar sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.6 Skrining Fitokimia

3.6.1 Pemeriksaan alkaloida

Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk tes alkaloida, diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada tabung pertama ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer, tabung kedua ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, dan tabung ketiga ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff. Alkaloida disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas Depkes RI, 1995.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 10 gram serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 gram serbuk Mg dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, lalu dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.6.3 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 gram serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 96 dan 3 bagian air suling, ditambahkan dengan asam klorida 2N hingga pH larutan adalah 2, direfluks selama 10 menit, dinginkan dan disaring. 35 Sebanyak 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M dikocok dan didiamkam selama 5 menit, lalu disaring. Sebanyak 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M dan dikocok lalu didiamkan selama 5 menit, disaring. Filtrat diekstraksi dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 bagian isopropanol, ini dilakukan sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut: larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air, sisanya ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, bila terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya gula Depkes RI, 1995.

3.6.4 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat- kuat selama 10 detik, jika terbentuk buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 - 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N buih tidak hilang maka menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.

3.6.5 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida, bila terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1979. 36

3.6.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 gram serbuk simplisia ditimbang, lalu dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap, pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat, apabila timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroidtriterpenoid Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Kitolod

Pembuatan ekstrak daun kitolod dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut metanol. Cara kerja: Sebanyak 330 gram serbuk simplisia daun kitolod dibasahi dengan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 3 jam, kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator. Larutan penyari metanol dituang secukupnya sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari di atasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan 20 tetes per menit, perkolasi dihentikan pada saat beberapa tetes perkolat tidak bereaksi ketika ditambahkan pereaksi Mayer, Bouchardat dan Dragendorff. Pelarut yang digunakan sebanyak 6 liter. Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat penguap vakum putar rotary evaporator pada temperatur yang tidak lebih dari 50 o C sampai diperoleh ekstrak kental daun kitolod Depkes RI, 1995. Bagan pembuatan ekstrak metanol dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 56 .