22 g. jumlah cuplikan yang digunakan
h. suhu i. kesetimbangan
2.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif
Metode pemisahan senyawa bahan alam yang memakai peralatan yang paling dasar merupakan kromatografi lapis tipis KLT preparatif. Ketebalan penyerap yang
sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Ketebalan lapisan yang terbatas dan ukuran plat sudah tentu
mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. KLT preparatif dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar
pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan senyawa lipofil maupun campuran
senyawa hidrofil. Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik Hostettmann, et al., 1995.
Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar pita sesempit mungkin karena
pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan
dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan uap pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang tercelup ke
dalam pengembang. Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita hasil pemisahan yang menyerap
sinar ultraviolet. Mendeteksi senyawa yang tidak menyerap dari sinar ada beberapa pilihan Hostettmann, et al., 1995:
23 a. menyemprot dengan air misalnya saponin.
b. menutup plat dengan sepotong kaca,lalu menyemprot salah satu sisi menggunakan pereaksi semprot.
c. menambahkan senyawa pembanding
2.5.3 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC
KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia
yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Dua sistem fase gerak yang berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama maka KLT dua dimensi dapat dipakai untuk memeriksa
kemurnian isolat. KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa
dengan fase gerak pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dikeluarkan dari chamber pengembang dan fase gerak dibiarkan menguap dari lempeng. Lempeng
dimasukkan ke dalam chamber yang menggunakan fase gerak kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah
pengembangan yang pertama. Pemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektifitas eluen pertama Rohman, 2009.
2.6 Spektrofotometri
2.6.1 Spektrofotometri sinar ultraviolet
Kategori