Spektrofotometri sinar ultraviolet Spektrofotometri sinar inframerah

23 a. menyemprot dengan air misalnya saponin. b. menutup plat dengan sepotong kaca,lalu menyemprot salah satu sisi menggunakan pereaksi semprot. c. menambahkan senyawa pembanding

2.5.3 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC

KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Dua sistem fase gerak yang berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama maka KLT dua dimensi dapat dipakai untuk memeriksa kemurnian isolat. KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan fase gerak pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dikeluarkan dari chamber pengembang dan fase gerak dibiarkan menguap dari lempeng. Lempeng dimasukkan ke dalam chamber yang menggunakan fase gerak kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Pemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektifitas eluen pertama Rohman, 2009. 2.6 Spektrofotometri

2.6.1 Spektrofotometri sinar ultraviolet

Spektrum ultraviolet adalah suatu gambaran yang menyatakan hubungan di antara panjang gelombang atau frekuensi sinar UV terhadap intensitas serapan. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200 - 400 nm. Serapan cahaya oleh 24 molekul dalam daerah spektrum ultraviolet sangat tergantung pada struktur elektronik dari molekul yang bersangkutan Sastrohamidjojo, 1985. Penyerapan radiasi UV terjadi melalui eksitasi elektron dalam suatu molekul obat ke level energi yang lebih tinggi. Transisi ini terjadi dari tingkat elektronik dasar suatu molekul ke salah satu level dalam keadaan elektronik tereksitasi Gandjar dan Rohman, 2012. Tipe eksitasi tergantung pada panjang gelombang yang diserap cahaya. Gugus yang dapat mengabsorpsi cahaya sinar ultraviolet disebut gugus kromofor Dachriyanus, 2004. Pelarut yang banyak digunakan untuk spektrofotometri sinar UV adalah etanol 95 karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut dan etanol tidak menyerap sinar UV. Pelarut lain yang digunakan adalah air, metanol, n-heksana, eter minyak bumi dan eter. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan cara mengukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert - Beer Gandjar dan Rohman, 2007; Harborne, 1987. Spektrofotometer UV pada umumnya digunakan untuk: 1. menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan ausokrom dari suatu senyawa organik. 2. menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombangnya. Dachriyanus, 2004.

2.6.2 Spektrofotometri sinar inframerah

Spektrofotometri inframerah pada umumnya digunakan untuk: 1. menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik. 2. mengetahui informasi senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jari. 25 Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya inframerah tengah mid-infrared yaitu pada panjang gelombang 2.5 - 50 �m atau bilangan gelombang 4000 - 200 cm -1 . Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorpsi sinar inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi Dachriyanus, 2004. Hanya frekuensi energi dari radiasi inframerah tertentu yang dapat diserap oleh suatu molekul. Agar molekul dapat menyerap radiasi inframerah, maka molekul harus mempunyai gambaran, yakni momen dipol pada molekul harus berubah selama vibrasi Gandjar dan Rohman, 2012. Daerah inframerah terletak antara spektrum elektromagnetik cahaya tampak dan spektrum radio, yakni antara bilangan gelombang 4000 - 400 cm -1 . Penggunaan spektrofotometri inframerah lebih banyak ditujukan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Spektrum inframerah senyawa organik bersifat khas, artinya senyawa yang berbeda akan mempunyai spektrum yang berbeda pula Noerdin, 1985. Penafsiran spektrum inframerah dari suatu senyawa yang belum diketahui ditujukan pada penentuan ada atau tidaknya gugus fungsional utama seperti C=O, O- H, N-H, C-O, C=C, C ≡C, C=N, C≡N, dan NO 2. Langkah-langkah yang dilakukan untuk memeriksa pita - pita yang terpenting pada hasil dari spektrum inframerah Pavia, et al., 1988: 1. Gugus karbonil Gugus C=O memberikan puncak yang kuat pada daerah 1820-1660 cm -1 . 2. Bila gugus C=O ada, periksalah gugus-gugus berikut jika C=O tidak ada maka 26 langsung ke nomor 3. Asam : lihat gugus O-H, merupakan serapan melebar di daerah 3300- 2500 cm -1 . Amida : lihat gugus N-H, merupakan serapan medium di daerah 3500 cm -1 , kadang-kadang dengan puncak rangkap. Ester : lihat gugus C-O, merupakan serapan medium di daerah 1300- 1000 cm -1 . Anhidrida : mempunyai dua serapan C=O di daerah 1810 dan 1760 cm- 1 . Aldehida : lihat gugus C-H, merupakan dua serapan lemah di daerah 2850 dan 2750 cm -1 yaitu disebelah kanan serapan C-H. Keton : kemungkinan bila kelima senyawa di atas tidak ada. 3. Bila gugus C=O tidak ada Alkohol atau fenol : lihat gugus O-H, serapan melebar di daerah 3600-3300 cm- 1 yang diikuti adanya serapan C- O di daerah 1300- 1000 cm -1 . Amina : lihat gugus N-H, yaitu serapan medium di daerah 3500 cm -1 . Eter : lihat gugus C-O dan tidak adanya O-H, yaitu serapan medium di daerah 1300-1000 cm -1 . 4. Ikatan rangkap dua atau cincin aromatik − Serapan lemah C=C di daerah 1650 cm -1 . − Serapan medium sampai kuat pada daerah 1650-1450 cm -1 menunjukkan dari adanya cincin aromatik. 27 − cocokkan kemungkinan di atas dengan memperhatikan serapan pada daerah C-H aromatik di sebelah kiri 3000 cm -1 , sedangkan C-H alifatis terjadi di sebelah kanan daerah tersebut. 5. Ikatan rangkap tiga − Serapan medium dan tajam dari C≡N di daerah bilangan gelombang 2250 cm -1 . − Serapan medium dan tajam dari C≡C di daerah bilangan gelombang 2150 cm -1 . 6. Gugus nitro − Dua serapan yang kuat di daerah 1600-1500 cm -1 dan 1390-1300 cm -1 . 7. Hidrokarbon − Apabila keenam serapan di atas tidak ada. − Serapan C-H alifatis di daerah sebelah kanan 3000 cm -1 . − Serapan yang sangat sederhana di daerah 1450 cm -1 CH2 dan 1375 cm -1 CH3. 28

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis ekstrak dengan kromatografi lapis tipis, isolasi alkaloida dengan metode pengocokan asam basa, uji kemurnian isolat dan karakterisasi isolat dengan spektrofotometri ultraviolet dan spektrofotometri inframerah.

3.1. Alat-Alat yang Digunakan