Fase gerak pelarut pengembang Alat-Alat yang Digunakan Bahan-Bahan yang Digunakan

20 panjang 366 nm. Senyawa tidak dapat dideteksi maka harus disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan Gritter, et al., 1991; Stahl, 1985. Kromatografi lapis tipis dapat dipakai untuk dua tujuan yaitu: 1. Metode untuk mencapai hasil kualitatif analitik dan kuantitatif preparatif. 2. Mencari sistem pelarut yang akan dipakai dalam kromatografi kolom Gritter, et al., 1991; Stahl, 1985.

a. Fase diam lapisan penyerap

Pada kromatografi lapis tipis pada fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca atau logam. Lapisan fase diam melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat. Beberapa contoh fase diam yang digunakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapis tipis yaitu silika gel, alumina, kieselguhr dan selulosa. Kromatografi lapis tipis lapisan fase diam harus sesedikit mungkin mengandung air, karena air akan menempati semua titik penyerapan sehingga tidak akan ada senyawa yang melekat, maka sebelum digunakan plat kromatografi lapis tipis perlu diaktifkan dengan pemanasan pada 110 o C selama 30 menit Gritter, et al., 1991.

b. Fase gerak pelarut pengembang

Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri dari satu atau campuran pelarut, jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas tiga komponen Stahl, 1985. Pemisahan pada KLT dikendalikan oleh rasio distribusi komponen dalam sistem fase diam atau penyerap dan fase gerak tertentu. Pemisahan pada KLT dapat dimodifikasi dengan mengubah rasio distribusi komposisinya pada fase gerak dengan 21 memperhatikan polaritasnya Gandjar dan Rohman, 2012. Hal ini sepasang pelarut atau lebih yang dapat saling melarutkan akan memisah menjadi menjadi dua lapisan. Hal ini lazim terjadi pada dua pelarut yang sangat berbeda kepolarannya dicampur sehingga dapat dilihat berupa bercak berbentuk bulan setengah, bukan bentuk yang bundar atau lonjong Gritter, et al., 1991.

c. Harga Rf

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan harga Rf Retardation Factor = faktor penghambatan Stahl, 1985. Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan pelarut dari titik awal Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Harga Rf berada antara 0,00 – 1,00. Harga Rf ini sangat berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa Eaton, 1989. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut Sastrohamidjojo, 1985: a. struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan b. bersifat penyerap c. tebal dan kerataan lapisan penyerap d. jenis pelarut dan derajat kemurniannya e. derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f. teknik percobaan 22 g. jumlah cuplikan yang digunakan h. suhu i. kesetimbangan

2.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif

Metode pemisahan senyawa bahan alam yang memakai peralatan yang paling dasar merupakan kromatografi lapis tipis KLT preparatif. Ketebalan penyerap yang sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Ketebalan lapisan yang terbatas dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. KLT preparatif dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik Hostettmann, et al., 1995. Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar pita sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan uap pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang tercelup ke dalam pengembang. Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita hasil pemisahan yang menyerap sinar ultraviolet. Mendeteksi senyawa yang tidak menyerap dari sinar ada beberapa pilihan Hostettmann, et al., 1995: 23 a. menyemprot dengan air misalnya saponin. b. menutup plat dengan sepotong kaca,lalu menyemprot salah satu sisi menggunakan pereaksi semprot. c. menambahkan senyawa pembanding

2.5.3 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC

KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Dua sistem fase gerak yang berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama maka KLT dua dimensi dapat dipakai untuk memeriksa kemurnian isolat. KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel di salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya sebagaimana biasa dengan fase gerak pertama. Lempeng kromatografi selanjutnya dikeluarkan dari chamber pengembang dan fase gerak dibiarkan menguap dari lempeng. Lempeng dimasukkan ke dalam chamber yang menggunakan fase gerak kedua sehingga pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangan yang pertama. Pemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektifitas eluen pertama Rohman, 2009. 2.6 Spektrofotometri

2.6.1 Spektrofotometri sinar ultraviolet

Spektrum ultraviolet adalah suatu gambaran yang menyatakan hubungan di antara panjang gelombang atau frekuensi sinar UV terhadap intensitas serapan. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200 - 400 nm. Serapan cahaya oleh 24 molekul dalam daerah spektrum ultraviolet sangat tergantung pada struktur elektronik dari molekul yang bersangkutan Sastrohamidjojo, 1985. Penyerapan radiasi UV terjadi melalui eksitasi elektron dalam suatu molekul obat ke level energi yang lebih tinggi. Transisi ini terjadi dari tingkat elektronik dasar suatu molekul ke salah satu level dalam keadaan elektronik tereksitasi Gandjar dan Rohman, 2012. Tipe eksitasi tergantung pada panjang gelombang yang diserap cahaya. Gugus yang dapat mengabsorpsi cahaya sinar ultraviolet disebut gugus kromofor Dachriyanus, 2004. Pelarut yang banyak digunakan untuk spektrofotometri sinar UV adalah etanol 95 karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut dan etanol tidak menyerap sinar UV. Pelarut lain yang digunakan adalah air, metanol, n-heksana, eter minyak bumi dan eter. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan cara mengukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert - Beer Gandjar dan Rohman, 2007; Harborne, 1987. Spektrofotometer UV pada umumnya digunakan untuk: 1. menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan ausokrom dari suatu senyawa organik. 2. menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombangnya. Dachriyanus, 2004.

2.6.2 Spektrofotometri sinar inframerah

Spektrofotometri inframerah pada umumnya digunakan untuk: 1. menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik. 2. mengetahui informasi senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jari. 25 Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya inframerah tengah mid-infrared yaitu pada panjang gelombang 2.5 - 50 �m atau bilangan gelombang 4000 - 200 cm -1 . Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorpsi sinar inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi Dachriyanus, 2004. Hanya frekuensi energi dari radiasi inframerah tertentu yang dapat diserap oleh suatu molekul. Agar molekul dapat menyerap radiasi inframerah, maka molekul harus mempunyai gambaran, yakni momen dipol pada molekul harus berubah selama vibrasi Gandjar dan Rohman, 2012. Daerah inframerah terletak antara spektrum elektromagnetik cahaya tampak dan spektrum radio, yakni antara bilangan gelombang 4000 - 400 cm -1 . Penggunaan spektrofotometri inframerah lebih banyak ditujukan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Spektrum inframerah senyawa organik bersifat khas, artinya senyawa yang berbeda akan mempunyai spektrum yang berbeda pula Noerdin, 1985. Penafsiran spektrum inframerah dari suatu senyawa yang belum diketahui ditujukan pada penentuan ada atau tidaknya gugus fungsional utama seperti C=O, O- H, N-H, C-O, C=C, C ≡C, C=N, C≡N, dan NO 2. Langkah-langkah yang dilakukan untuk memeriksa pita - pita yang terpenting pada hasil dari spektrum inframerah Pavia, et al., 1988: 1. Gugus karbonil Gugus C=O memberikan puncak yang kuat pada daerah 1820-1660 cm -1 . 2. Bila gugus C=O ada, periksalah gugus-gugus berikut jika C=O tidak ada maka 26 langsung ke nomor 3. Asam : lihat gugus O-H, merupakan serapan melebar di daerah 3300- 2500 cm -1 . Amida : lihat gugus N-H, merupakan serapan medium di daerah 3500 cm -1 , kadang-kadang dengan puncak rangkap. Ester : lihat gugus C-O, merupakan serapan medium di daerah 1300- 1000 cm -1 . Anhidrida : mempunyai dua serapan C=O di daerah 1810 dan 1760 cm- 1 . Aldehida : lihat gugus C-H, merupakan dua serapan lemah di daerah 2850 dan 2750 cm -1 yaitu disebelah kanan serapan C-H. Keton : kemungkinan bila kelima senyawa di atas tidak ada. 3. Bila gugus C=O tidak ada Alkohol atau fenol : lihat gugus O-H, serapan melebar di daerah 3600-3300 cm- 1 yang diikuti adanya serapan C- O di daerah 1300- 1000 cm -1 . Amina : lihat gugus N-H, yaitu serapan medium di daerah 3500 cm -1 . Eter : lihat gugus C-O dan tidak adanya O-H, yaitu serapan medium di daerah 1300-1000 cm -1 . 4. Ikatan rangkap dua atau cincin aromatik − Serapan lemah C=C di daerah 1650 cm -1 . − Serapan medium sampai kuat pada daerah 1650-1450 cm -1 menunjukkan dari adanya cincin aromatik. 27 − cocokkan kemungkinan di atas dengan memperhatikan serapan pada daerah C-H aromatik di sebelah kiri 3000 cm -1 , sedangkan C-H alifatis terjadi di sebelah kanan daerah tersebut. 5. Ikatan rangkap tiga − Serapan medium dan tajam dari C≡N di daerah bilangan gelombang 2250 cm -1 . − Serapan medium dan tajam dari C≡C di daerah bilangan gelombang 2150 cm -1 . 6. Gugus nitro − Dua serapan yang kuat di daerah 1600-1500 cm -1 dan 1390-1300 cm -1 . 7. Hidrokarbon − Apabila keenam serapan di atas tidak ada. − Serapan C-H alifatis di daerah sebelah kanan 3000 cm -1 . − Serapan yang sangat sederhana di daerah 1450 cm -1 CH2 dan 1375 cm -1 CH3. 28

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis ekstrak dengan kromatografi lapis tipis, isolasi alkaloida dengan metode pengocokan asam basa, uji kemurnian isolat dan karakterisasi isolat dengan spektrofotometri ultraviolet dan spektrofotometri inframerah.

3.1. Alat-Alat yang Digunakan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, cawan penguap, spatula, blender Panasonic, eksikator, seperangkat alat destilasi, chamber, plat KLT dan plat kaca KLT preparatif, pipet kapiler, spray kromatografi, oven listrik Stork, tanur, krus porselen, penjepit tabung, kertas saring bebas abu, labu bersumbat, hair dryer Maspion, neraca analitik Vibra AJ, neraca kasar Saherand, penangas air Yenaco, rotary evaporator Boeci 461, lemari pengering, mikroskop Olympus, penjepit tabung, objek glass, deck glass, lampu spiritus, tisu lensa, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu dan spektrofometer IR IR- Prestige 21.

3.2. Bahan-Bahan yang Digunakan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah, sebagai sampel digunakan daun kitolod Hippobroma longiflora L. G. Don. Semua bahan yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah yang berkualitas proanalisa yaitu n- heksana, etilasetat, etanol, amil alkohol, benzen, toluen, metanol, kloroform, diklorometan, α-naftol, besi III klorida, iodium, raksa II klorida, kloralhidrat, 29 timbal II asetat, kalium iodida, asam sulfat pekat, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, bismut III nitrat, serbuk magnesium, amonia, kalium bromida, kloralhidrat, dan floroglusin HCI, air suling,

3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi