3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan
disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Lay, 1994.
3.8 Pembuatan Media 3.8.1
Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI
Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L- glutamine tanpa NaHCO
3
, netto 10,4 gram Hepes
2 gram NaHCO
3
2 gram HCl 1N
secukupnya NaOH 1N
secukupnya Aquabidest steril
ad 1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 800 ml aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan Stirer magnet, kemudian pH diukur dengan
pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4, karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N untuk menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides
steril sampai 1 L, dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF Laminar Air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril,
lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan,
expire date, dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.8.2 Pembuatan media komplit MK-RPMI
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Universitas Sumatera Utara
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amphotericin B 0,5 RPMI
ad 100 ml
Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air
Flow, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.8.3 Pembuatan media M199
Komposisi: M199 sachet, spesifikasi GIBCO Lot No. 819942, dengan Earle’s salt, dengan L-glutamine, tanpa NaHCO
3
, netto 9,5 gram Akuabidest
1 liter NaHCO
3
2,2 gram Hepes
2 gram HCl 1 N
NaOH 1 N
Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet M199, 2,2 gram NaHCO
3
, 2 gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 ml aquabidest steril dan di
homogenkan menggunakan Stirer magnet. Diatur pH 7,2 – 7,4 dengan menggunakan pH meter. Karena terlalu asam maka digunakan NaOH 1N untuk
menyesuaikan pH. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vacum di dalam LAF Laminar Air Flow. Dipasang filter
aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi
identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001.
Universitas Sumatera Utara
3.8.4 Pembuatan MK-M199
Komposisi : Foetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin
3 Fungison
1. M199
ad 100 ml Cara Pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001. 3.9 Penumbuhan Sel
3.9.1 Penumbuhan sel T47D
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 ml media RPMI pada tabung konikel 15 ml, diambil ampul sel T47D dari
freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan dicairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul, dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI
yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan ditambahkan 4 ml MK-RPMI dan diresuspensi hingga homogen.
Ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 ml MK-RPMI ke dalam masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Diamati
kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu.
diberi identitas pada flask kultur, kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
Doyle, et al., 2000.
3.9.2 Subkultur sel T47D
dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. dilakukan proses panen sel T47D dengan cara diambil 500
Universitas Sumatera Utara
µl panenan sel T47D dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 ml MK-RPMI, dihomogenkan. Diinkubasi sel pada inkubator CO
2
, diamati kondisi sel pada keesokan harinya
Doyle, et al., 2000.
3.9.3 Panen sel T47D
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Salin,
ditambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-
satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Diresuspensi sel kembali karena masih ada sel yang menggerombol. Ditransfer sel
ke dalam tabung konikel Doyle, et al., 2000.
3.9.4 Penumbuhan sel Vero
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan. Seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Aliquot 10 ml media M199 dimasukkan ke
dalam tabung konikel 15 ml, kemudian ampul yang berisi sel biakan diambil dari freezer -80
C dan dicairkan pada suhu kamar. Suspensi sel dalam ampul diambil, lalu dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media, lalu disentrifuge pada 600 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 4 ml MK-M199, kemudian diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing 2 ml ke
dalam flask kultur baru. Sebanyak 5 ml MK-M199 ditambahkan ke dalam masing- masing flask, lalu dihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan
Universitas Sumatera Utara
mikroskop inverted. Sel dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask tidak bergerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi identitas, dan
kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
5 Doyle, et al., 2000.
3.9.5 Subkultur sel Vero
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan, seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Proses panen sel Vero dilakukan dengan cara
mengambil 500 µl panenan sel dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Kemudian ditambahkan 6 ml media kultur sel Vero, dan dihomogenkan. Sel Vero diinkubasi
pada inkubator CO
2
5, kondisi sel diamati pada keesokan harinya Doyle, et al.,
2000.
3.9.6 Panen sel sel Vero
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel Vero. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen,
semua pekerjaan dilakukan pada LAF. Buang MK-M199 dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer
Salin, ditambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel
terlepas satu-satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Diresuspensi sel kembali kareana masih ada sel yang menggerombol.
ditransfer sel ke dalam tabung konikel Doyle, et al., 2000.
3.9.7 Penghitungan sel T47D dan sel Vero
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 µl panenan sel dan dipipet ke dalam hemositometer. Dihitung jumlah sel dibawah
Universitas Sumatera Utara
mikroskop dengan menggunakan counter. Gambar Hemositometer kamar hitung dapat dilihat pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Hemositometer kamar hitung
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Dihitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang
gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per ml
dengan rumus Nugroho, et al., 2012:
Setelah jumlah per ml didapat kemudian dihitung volume panenan sel yang diperlukan, dimana untuk menanam sel pada 96-well plate jumlah total sel
yang diperlukan adalah 1 x 10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1 x 10
6
, volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dihitung dengan rumus:
Volume panenan sel yang diperlukan Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan.
Universitas Sumatera Utara
3.10 Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 50 mg dalam polytube, kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1000 µl, di vortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian di cukupkan dengan MK-RPMI, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi
250 µgml, 125 µgml, 62,5 µgml, 31,25 µgml dan 15,625 µgml, semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK.
3.11 Pengujian Sitotoksik
Sel T47D ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37
o
C selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan ekstrak sampel uji dan
diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma.
Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur RPMI dan 10
μL MTT. Sel diinkubasi kembali selama 4 - 6 jam dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam
HCl 0,01 N, lalu plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark
Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Adina, 2009.
3.12 Pengujian Sel Vero
Sel Vero dari tabung dicairkan dalam pemanas air 37
o
C kemudian disemprot alkohol 80. Di dalam laminar flow hood sel vero dipindahkan
Universitas Sumatera Utara
kedalam tabung sentrifus steril yang berisi 10 ml medium M 199. Suspensi sel disentrifugasi pada 1200 rpm selama 5 menit kemudian supernatan dibuang dan
diganti medium M 199 segar. Setelah didiamkan selama 20 menit sel disentrifus lagi pada 1200 rpm selama 5 menit. Cairan supernatan dibuang dan disisakan
sedikit 1ml untuk meresuspensi sel Vero. Setelah diresuspensi menjadi sel homogen sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask TFC kecil dengan medium
penumbuh yang mengandung 20 FBS MK-M199.
Sel diamati dibawah inverted microscope. Apabila pertumbuhan sel telah konfluen sel ditampung dalam tabung sentrifuse dan disentrifugasi selama 5 menit
pada 2000 rpm. Cairan supernatan dibuang dan disisakan 2 ml untuk meresuspensi platelet. Setelah diresuspensi menjadi suspensi sel yang homogen,
Tambahkan medium MK-M199 ke sel Vero dikembangkan menjadi tiga atau empat TFC kecil. Untuk mendapatkan sel Vero fase logaritmik setiap hari sel
dipanen dan dikembangkan dalam medium segar, sejak 4 hari sebelum fusi. Endapan sel vero kemudian disus- pensikan pada media M 199 dan ditentukan
kerapatan sel sebesar 2 x 10
5
selml. Suspensi sel dibagi ke dalam sumuran- sumuran yang tiap sumuran sebanyak 100 µm suspensi dan kemudian
ditambahkan kedalamnya larutan atau suspensi ekstrak sampel uji dalam berbagai konsentrasi yang selanjutnya disebut sample. Pada kontrol positif yang
ditambahkan adalah larutan doksorubisin juga dalam berbagai kadar sedang pada kontrol negatif adalah media M 199. Sampel diinkubasi sampai pertumbuhan sel
konfluen dan kemudian dilakukan pengecatan dengan triphan blue. Sel yang mati akan menyerap warna sedang yang hidup tetap berwarna putih mengkilat sehingga
dapat ditentukan kadar hambat minimum senyawa uji. Adina, 2009.
Universitas Sumatera Utara
3.13 Analisis Hasil
Kategori