3.13 Analisis Hasil
Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik, sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan IC
50
konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel yang dianalisis dengan analisis probit
menggunakan SPSS 17 Meiyanto, dkk., 2008.
3.14 Indeks Selektivitas IS
Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan
ekstrak ekstrak pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma.
Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL MTT
Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4 - 6 jam dalam inkubator CO
2
5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu
malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al., 2012.
Indek selektivitas index dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
Universitas Sumatera Utara
3.15 Uji Kombinasi
Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah Isobologram dan indeks kombinasi
IK= D
1
Dx
1
+ D
2
Dx
2
Dx: konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC
50
terhadap pertumbuhan sel kanker payudara. D1 dan D2: besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang
sama. Huruf indeks kombinasi IK yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada Tabel 3.1 Reynolds dan Maurer, 2005.
Tabel 3.1 Interpretasi nilai indeks kombinasi IK
Digunakan kultur sel dalam kondisi 70 - 80 konfluen untuk dipanen. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji kombinasi adalah 1 x 10
4
selsumuran 1 x 10
4
sel100 ml MK. Dibuat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 1 x 10
4
sel100 ml MK. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi sel agar tetap homogen. Disisakan
3 sumuran kosong untuk kontrol media. Diamati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Inkubasi sel di dalam inkubator selama 24 jam. Setelah sel
normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi doksorubisin untuk perlakuan. Seri konsentrasi ekstrak dan doksorubisin terdiri
dari 4 konsentrasi: ½ IC50,
3 8
IC50, ¼ IC50 dan
1 8
IC50. Diambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. Buang media sel dengan cara balikkan plate 180
di
IK Interpretasi IK Interpretasi
0,1 sinergis sangat kuat
0,1–0,3 sinergis kuat
0,3–0,7 sinergis
0,7–0,9 sinergis ringan-sedang
0,9–1,1 mendekati additif
1,1–1,45 antagonis ringan-sedang 1,45–3,3 antagonis
3,3 antagonis kuat-sangat kuat
Universitas Sumatera Utara
atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan. Cuci sel dalam sumuran dengan masing-masing 100
mL PBS. Buang PBS, tiriskan sisa cairan dengan tisu. Untuk kelompok perlakuan kombinasi:
Dimasukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran 50 µl dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian tambahkan seri konsentrasi doksorubisin untuk
kombinasi 50 µl. Untuk kelompok perlakuan tunggal:
Dimasukkan seri konsentrasi sampel atau agen kemoterapi ke dalam sumuran 50 µl dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian tambahkan MK 50 µl ke dalam
sumuran. Untuk kontrol sel:
Ditambahkan MK ke dalam sumuran yang berisi sel 100 µl dengan replikasi 3 kali triplo.
Untuk kontrol media: Ditambahkan MK ke dalam sumuran yang kosong tanpa sel 100 µl dengan
replikasi 3 kali triplo. Diinkubasi di dalam inkubator CO
2
. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum
terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam waktu inkubasi total 24- 48 jam. Dibuat stok MTT 5 mgml dengan cara timbang 50 mg serbuk MTT,
larutkan dalam 10 mL PBS dengan bantuan vortex. Buat reagen MTT untuk perlakuan 0,5 mgml dengan cara ambil 1 ml stok MTT 5 mgml, encerkan
dengan MK ad 10 ml. Reagen ini dibuat untuk 1 buah 96 well plate. Buang media sel, cuci masing-
masing dengan 100 μL PBS 1x. Tambahkan 100 ml reagen MTT
Universitas Sumatera Utara
0,5 mgml 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media tanpa sel. Inkubasi sel selama 2 - 4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang
ungu. Setelah 2 - 4 jam, periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N.
Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya, plate di-shaker selama
10 menit untuk melarutkan formazan. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke
dalam ELISA reader. Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader
dengan λ = 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP, dan matikan ELISA reader. Hitung harga
indeks kombinasi IK Nugroho, et al.,. 3.16
Pengujian Apoptosis dan Siklus Sel dengan Metode Flowsitometri
Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji siklus sel dan apoptosis adalah sebanyak 5 x 10
5
– 1 x 10
6
selsumuran yang kemudian ditanam pada microplate 6 sumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam. Keesokan harinya sel ditambahkan
sampel uji lalu diinkubasi kembali selama 24 jam. Kemudian diambil media pada masing-masing sumuran pada tiap konsentrasi lalu dimasukkan dalam tabung
conical 15 ml lalu media dicuci dengan PBS 1x dan ditampung pada conical yang sama. Ditambahkan tripsin 250 µl pada tiap sumuran lalu diinkubasi selama 3
menit pada suhu 37 C pastikan di bawah mikroskop sel tidak menggerombol satu
sama lain untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Setelah itu ditambahkan 1 ml media kultur lalu media ditampung pada tabung conical 15 ml. Disentrifugasi
dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Lalu
Universitas Sumatera Utara
ditambahkan sebanyak 1 ml PBS kemudian media dipindahkan ke dalam tabung conical 1,5 ml dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit,
setelah itu supernatannya dibuang. Kemudian ditambahkan propidium iodida atau
aneksin V dan diukur dengan alat flowcytometer Hostanska, et al., 2004.
3.17
Uji Penekanan Ekspresi Protein Bcl2 dan Siklin D1 dengan Metode Imunositokimia
Sebelum sel T47D ditanam terlebih dahulu pada masing-masing sumuran 24 - well plate dimasukkan coverslip. Sel ditanam dengan kepadatan 5 x 10
5
selsumuran, diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator CO
2
5 lalu dibuang medium. Sel yang telah diinkubasi kemudian ditambahkan larutan uji dan
doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi masing-masing 1 IC
50
dan ½ IC
50
. Pada kelompok kontrol, ditambahkan 1000 µl media kultur. Sel kembali diinkubasi selama 24 jam, dibuang larutan uji dan media kultur dibuang.
Kemudian dicuci dengan PBS 2 kali. Sel difiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit. Setelah itu coverslip di masing-masing sumuran diangkat dengan pinset
secara hati-hati dan diletakkan di atas kaca objek lalu dicuci dengan PBS 2 kali, dicuci dengan aquadest lalu keringkan, tambahkan blocking serum, disimpan pada
sumur kamar diamkan 15 menit, tambahkan antibodi primer Bcl-2siklin D1 diamkan 60 menit, dicuci PBS 2 kali, tambahkan antibodi sekunder Bcl-2siklin
D1 lalu keringkan, tambahkan larutan label dan cuci PBS 2 kali selanjutnya dikeringkan, ditambahkan campuran 1 : 100 DAB substrat. Selanjutnya dicuci
dengan aquadest, digenangi dengan hematoxicillin dan divisualisasikan dengan reaksi warna. Ekspresi Bcl-2siklin D1 diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Sel yang diamkan 10 menit. Ditambah etanol absolute, selanjutnya ditambahkan
Universitas Sumatera Utara
xylol dan tambahkan entelan. Mengekspresikan Bcl-2siklin D1 akan memberikan warna coklatgelap, sedangkan yang tidak terekspresi akan memberikan warna
ungu biru. Jumlah sel dihitung pada luasan tertentu, baik yang berwarna
coklatgelap maupun yang berwarna ungubiru Cho, et al., 2009.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor - Pusat Penelitian Biologi adalah tumbuhan bawang
sabrang dengan nama Eleutherine bulbosa Mill. Urb. suku Iridaceae. Hasil identifikasi dan gambar tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1.
4.2 Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak
Hasil pemeriksaan makroskopik umbi lapis bawang sabrang berbentuk bulat telur memanjang, berwarna merah, tidak berbau, serta berasa pahit. Umbi
lapis terdiri dari 5-6 lapisan dengan pangkal daun di tengahnya dan biasanya memiliki panjang 4-5 cm dan diameter 1-3 cm, hasil ini sama dengan yang tertera
pada Ditjen POM 1989. Gambar tumbuhan, umbi lapis bawang sabrang dan simplisia umbi lapis bawang sabrang dapat dilihat pada lampiran 2 dan Lampiran
3. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia adalah berwarna merah muda dan sangat rapuh.
Pemeriksaan karakteristik umbi lapis bawang sabrang secara mikroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan karakteristik
serbuk simplisia secara mikroskopik pada lampiran 4 terlihat adanya pati, parenkim, hablur kalsium oksalat bentuk rafida dan berkas pembuluh penebalan
spiral. Mikroskopis dari penampang melintang umbi lapis bawang sabrang yaitu adanya epidermis luar, berkas pembuluh tipe kolateral tertutup, parenkim berisi
kalsium oksalat bentuk rafida dan parenkim berisi pati.
Universitas Sumatera Utara
Kategori