asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600 sampai
bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan Ditjen POM, 1989.
3.5 Penentuan Golongan Senyawa Kimia
Penentuan golongan senyawa kimia Skrining fitokimia dilakukan pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida
antrakinon Ditjen POM, 1989. saponin, tanin, glikosida sianogenik Farnsworth, 1966 dan triterpenoidsteroid Harborne, 1987.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada
masing-masing tabung reaksi: a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas Ditjen POM, 1989.
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g simplia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g
serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok
Universitas Sumatera Utara
dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat
disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur
tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa
digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air
dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu
pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula Ditjen POM, 1989.
3.5.3.1 pemeriksaan glikosida antrakinon
Ditimbang sebanyak 0,2 g simplisia, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzena tidak berwarna menunjukan adanya antrakinon Ditjen POM, 1989.
3.5.4 Pemeriksaan saponin S
implisia ditimbang 0,5 g, lalu dimasukan ke tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan, lalu dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk
Universitas Sumatera Utara
busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N menunjukan adanya saponin.
3.5.5 Pemeriksaan tanin
Simplisia sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes peraksi
besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman
menunjukan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.5.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan
beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau
ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987. 3.6 Pembuatan Ekstrak Umbi Lapis Bawang Sabrang
Sebanyak 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan kedalam sebuah bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari,
ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas dan dicuci dengan cairan penyari
secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Sari dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari.
Dienaptuangkan dan disaring Ditjen POM, 1979
Universitas Sumatera Utara
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan
disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Lay, 1994.
3.8 Pembuatan Media 3.8.1
Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI
Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L- glutamine tanpa NaHCO
3
, netto 10,4 gram Hepes
2 gram NaHCO
3
2 gram HCl 1N
secukupnya NaOH 1N
secukupnya Aquabidest steril
ad 1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 800 ml aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan Stirer magnet, kemudian pH diukur dengan
pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4, karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N untuk menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides
steril sampai 1 L, dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF Laminar Air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril,
lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan,
expire date, dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.8.2 Pembuatan media komplit MK-RPMI
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Universitas Sumatera Utara
