3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan
disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Lay, 1994.
3.8 Pembuatan Media 3.8.1
Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI
Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L- glutamine tanpa NaHCO
3
, netto 10,4 gram Hepes
2 gram NaHCO
3
2 gram HCl 1N
secukupnya NaOH 1N
secukupnya Aquabidest steril
ad 1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 800 ml aquabidest steril, dihomogenkan dengan menggunakan Stirer magnet, kemudian pH diukur dengan
pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4, karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N untuk menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides
steril sampai 1 L, dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF Laminar Air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril,
lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan,
expire date, dan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.8.2 Pembuatan media komplit MK-RPMI
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Universitas Sumatera Utara
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizone Amphotericin B 0,5 RPMI
ad 100 ml
Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air
Flow, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, et al., 1989.
3.8.3 Pembuatan media M199
Komposisi: M199 sachet, spesifikasi GIBCO Lot No. 819942, dengan Earle’s salt, dengan L-glutamine, tanpa NaHCO
3
, netto 9,5 gram Akuabidest
1 liter NaHCO
3
2,2 gram Hepes
2 gram HCl 1 N
NaOH 1 N
Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet M199, 2,2 gram NaHCO
3
, 2 gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 ml aquabidest steril dan di
homogenkan menggunakan Stirer magnet. Diatur pH 7,2 – 7,4 dengan menggunakan pH meter. Karena terlalu asam maka digunakan NaOH 1N untuk
menyesuaikan pH. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vacum di dalam LAF Laminar Air Flow. Dipasang filter
aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi
identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001.
Universitas Sumatera Utara
3.8.4 Pembuatan MK-M199
Komposisi : Foetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin
3 Fungison
1. M199
ad 100 ml Cara Pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001. 3.9 Penumbuhan Sel
3.9.1 Penumbuhan sel T47D
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 ml media RPMI pada tabung konikel 15 ml, diambil ampul sel T47D dari
freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan dicairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul, dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI
yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan ditambahkan 4 ml MK-RPMI dan diresuspensi hingga homogen.
Ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 ml MK-RPMI ke dalam masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Diamati
kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu.
diberi identitas pada flask kultur, kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
Doyle, et al., 2000.
3.9.2 Subkultur sel T47D
Kategori