3.8.4 Pembuatan MK-M199
Komposisi : Foetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin
3 Fungison
1. M199
ad 100 ml Cara Pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001. 3.9 Penumbuhan Sel
3.9.1 Penumbuhan sel T47D
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 ml media RPMI pada tabung konikel 15 ml, diambil ampul sel T47D dari
freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan dicairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul, dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI
yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan ditambahkan 4 ml MK-RPMI dan diresuspensi hingga homogen.
Ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 ml MK-RPMI ke dalam masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Diamati
kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu.
diberi identitas pada flask kultur, kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
Doyle, et al., 2000.
3.9.2 Subkultur sel T47D
dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. dilakukan proses panen sel T47D dengan cara diambil 500
Universitas Sumatera Utara
µl panenan sel T47D dan dimasukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 ml MK-RPMI, dihomogenkan. Diinkubasi sel pada inkubator CO
2
, diamati kondisi sel pada keesokan harinya
Doyle, et al., 2000.
3.9.3 Panen sel T47D
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Salin,
ditambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit, dan ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-
satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Diresuspensi sel kembali karena masih ada sel yang menggerombol. Ditransfer sel
ke dalam tabung konikel Doyle, et al., 2000.
3.9.4 Penumbuhan sel Vero
Alat dan bahan dipersiapkan dan dikondisikan pada suhu ruangan. Seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Aliquot 10 ml media M199 dimasukkan ke
dalam tabung konikel 15 ml, kemudian ampul yang berisi sel biakan diambil dari freezer -80
C dan dicairkan pada suhu kamar. Suspensi sel dalam ampul diambil, lalu dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media, lalu disentrifuge pada 600 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 4 ml MK-M199, kemudian diresuspensi hingga homogen. Suspensi sel ditransfer masing-masing 2 ml ke
dalam flask kultur baru. Sebanyak 5 ml MK-M199 ditambahkan ke dalam masing- masing flask, lalu dihomogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan
Universitas Sumatera Utara
mikroskop inverted. Sel dipastikan tersebar pada seluruh permukaan flask tidak bergerombol pada bagian tertentu. Pada flask kultur diberi identitas, dan
kemudian disimpan dalam inkubator CO
2
5 Doyle, et al., 2000.
3.9.5 Subkultur sel Vero
Kategori