3.4.2. Peremajaan Kapang Endofit
Isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari masing-masing morphotype ditanam pada cawan petri yang berisi media Potato Dextrose Agar PDA secara
duplo dan disimpan selama 7 hari pada suhu ruang. Isolat yang diremajakan tersebut disimpan sebagai kultur stok dan working culture.
3.4.3. Pengamatan Kapang Endofit
Pengamatan secara makroskopis dilakukkan dengan mengamati warna koloni kapang, bentuk area miselium kapang, bentuk tepi miselium kapang,
mengamati ada atau tidaknya bintik jingga dan bintik hitam serta kapang yang terdapat pada cawan didokumentasikan menggunakan kamera digital.
Pengamatan secara mikroskopis menggunakan mikroskop stereo dan mikroskop cahaya. Konidia diambil menggunakan ose secara aseptis. Bagian
permukaan koloni diambil dan diletakan diatas gelas objek yang telah ditetesi shear’s diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 sampai 1000
kali menggunakan minyak imersi.
3.4.4. Fermentasi Cair Kapang Endofit
Isolat tunggal yang telah diremajakan dari cawan petri diinokulasikan ke dalam medium fermentasi cair yaitu Potato Dextrose Broth PDB. Medium PDB
yang digunakan yaitu sebanyak 200 ml untuk setiap isolat. Pembuatan medium dilakukan dengan menimbang medium lalu dilarutkan dengan menggunakan
akuades. Medium dilarutkan dan dipanaskan diatas hot plate menggunakan magnetik stirrer sampai mendidih dan larut kemudian medium dimasukkan
kedalam botol fermentasi yang ditutup sumbat dan disterilisasi pada suhu 121
°
C selama 15 menit.
Inokulasi dilakukan dengan mengambil 3 cetakan dari isolat kapang yang ada didalam PDA cawan dengan sedotan steril lalu dimasukkan kedalam medium
PDB secara aseptis. Medium PDB tersebut diinkubasikan selama 21 hari pada suhu ruang 27
°
C tanpa pengocokan. Setelah 21 hari, hasil fermentasi dipisahkan antara filtrat dan biomassa dengan cara disaring untuk uji antioksidan.
3.4.5. Ekstraksi Hasil Fermentasi dengan Pelarut Organik
Hasil fermentasi yang telah disaring dan dipisahkan antara filtrat dan biomassa, kemudian diekstraksi cair cair pada filtrat dengan penambahan etil
asetat sedangkan ekstraksi cair cair pada biomassa menggunakan metanol.
a Ekstraksi cair cair terhadap filtrat ekstrak filtrat
Filtrat diberi etil asetat sebanyak 100 ml vv. Kemudian dikocok dalam corong terpisah, dan didiamkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas lapisan organik merupakan ekstrak etil asetat yang akan melarutkan senyawa-senyawa organik yang ada pada ekstrak kapang lalu fraksi ini
dipisahkan. Lapisan bawah merupakan fraksi air lalu fraksi tersebut ditambahkan etil asetat baru kemudian dikocok dengan corong pisah dan didiamkan beberapa
saat sampai terbentuk dua lapisan pengocokan fraksi air dengan etil asetat dilakukkan sebanyak tiga kali dan hanya lapisan atas saja yang diambil. Fraksi
etil asetat yang diperoleh disatukan dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator suhu 40
°
C sampai didapatkan ekstrak kering untuk uji antioksidan.
Kategori