kedalam botol fermentasi yang ditutup sumbat dan disterilisasi pada suhu 121
°
C selama 15 menit.
Inokulasi dilakukan dengan mengambil 3 cetakan dari isolat kapang yang ada didalam PDA cawan dengan sedotan steril lalu dimasukkan kedalam medium
PDB secara aseptis. Medium PDB tersebut diinkubasikan selama 21 hari pada suhu ruang 27
°
C tanpa pengocokan. Setelah 21 hari, hasil fermentasi dipisahkan antara filtrat dan biomassa dengan cara disaring untuk uji antioksidan.
3.4.5. Ekstraksi Hasil Fermentasi dengan Pelarut Organik
Hasil fermentasi yang telah disaring dan dipisahkan antara filtrat dan biomassa, kemudian diekstraksi cair cair pada filtrat dengan penambahan etil
asetat sedangkan ekstraksi cair cair pada biomassa menggunakan metanol.
a Ekstraksi cair cair terhadap filtrat ekstrak filtrat
Filtrat diberi etil asetat sebanyak 100 ml vv. Kemudian dikocok dalam corong terpisah, dan didiamkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas lapisan organik merupakan ekstrak etil asetat yang akan melarutkan senyawa-senyawa organik yang ada pada ekstrak kapang lalu fraksi ini
dipisahkan. Lapisan bawah merupakan fraksi air lalu fraksi tersebut ditambahkan etil asetat baru kemudian dikocok dengan corong pisah dan didiamkan beberapa
saat sampai terbentuk dua lapisan pengocokan fraksi air dengan etil asetat dilakukkan sebanyak tiga kali dan hanya lapisan atas saja yang diambil. Fraksi
etil asetat yang diperoleh disatukan dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator suhu 40
°
C sampai didapatkan ekstrak kering untuk uji antioksidan.
b Ekstraksi cair cair terhadap biomassa ekstrak biomassa
Biomassa hasil saringan diekstraksi dengan metanol sebanyak 100 ml vv dan dihaluskan menggunakan mortar sampai isolat kapang halus kemudian
dimaserasi dan di shaker selama 24 jam. Kemudian disaring untuk diambil filtratnya sedangkan biomassanya ampas diberi metanol baru maserasi
dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Hasil ekstraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator suhu 40
°
C sehingga diperoleh ekstrak pekat untuk dilakukkan uji antioksidan.
3.4.6. Uji Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Hasil Fermentasi
3.4.6.1. Metode DPPH Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Ekstrak pekat yang didapatkan dari biomassa dan filtrat sebanyak satu mg dilarutkan dengan 10 ml metanol lalu di vortex sampai larut, setelah itu
sampel ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis KLT begitu juga dengan pembuatan vitamin C sebagai kontrol. Pelat KLT dimasukkan ke dalam chamber
yang berisi fase gerak etil asetat: metanol : air dengan perbandingan 100:13,5:10 ml. Pelat yang telah mencapai garis akhir dikeluarkan dari chamber dan
dikeringkan. Kromatogram disemprot menggunakan larutan DPPH Tamat et al., 2007. Larutan stok DPPH disimpan kedalam botol gelap pembuatan larutan
DPPH selalu baru untuk setiap pengujian lalu diamkan selama 20 menit Saputri, 2013. Intensitas warna DPPH akan berubah dari warna ungu menjadi kuning
yang disebabkan oleh elektron yang berasal dari senyawa antioksidan Molyneux, 2004. Menurut Listiandiani 2011, bercak pada KLT diamati di bawah sinar UV
