Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

32

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi lama pemberian dekok biji Persea americana Mill. dengan dosis tertentu pada tikus terinduksi karbon tetraklorida. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar kreatinin dan struktur anatomi ginjal yang dilihat dari gambaran histologi ginjal tikus dengan pemberian jangka pendek dekok biji Persea americana Mill. pada tikus galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi hewan uji yaitu tikus galur Wistar dengan berat badan 150-250 g dan umur 2-3 bulan, cara pemberian nefrotoksin secara intraperitonial, cara pemberian dekok secara per oral, dan bahan uji yang digunakan berupa serbuk biji Persea americana Mill. b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini yaitu kondisi patologis dari tikus galur Wistar yang digunakan.

3. Definisi operasional

a. Variasi lama pemberian dekok biji Persea americana Mill. Variasi lama pemberian dekok dilakukan selama 1, 4, dan 6 jam sebelum diberikan nefrotoksin CCl 4 . b. Penurunan kadar kreatinin. Kemampuan dekok biji Persea americana Mill. pada dosis tertentu yang dapat menurunkan kadar kreatinin pada tikus galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. c. Kerusakan struktur anatomi ginjal. Kerusakan struktur ini dilihat dari gambaran histologi ginjal tikus yaitu ditandai dengan ditemukannya sel radang, fibrosa, cacat seluler seperti nekrosis sel-sel epitel pada glomerulus, nefritis tubulus dan interstisium, serta pembengkakan sel-sel tubulus proksimal sehingga terjadi penyempitan lumen hingga hilangnya lumen.

C. Bahan Penelitian 1.

Bahan utama a. Hewan uji yang digunakan berupa tikus galur Wistar umur 2-3 bulan dengan berat 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah biji Persea americana Mill yang diperoleh dari Padang pada bulan Januari 2013 .

2. Bahan kimia

a. Bahan nefrotoksin yang digunakan yaitu karbon tetraklorida merk Merck ® yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. b. Air suling sebagai pelarut yang digunakan untuk pembuatan sediaan uji diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. c. Aqua bidestilata untuk blanko pengujian kreatinin diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. d. Kontrol serum kreatinin Cobas ® Preci Control ClinChem Multi 2 RocheHitachi analyzer. e. Formalin 37 f. Olive oil merk Bertolli sebagai kontrol negatif. g. Reagen diasys untuk mengukur aktivitas serum kreatinin.

D. Alat Penelitian

1. Peralatan pembuatan dekok biji Persea americana Mill.

Panci enamel, termometer, stopwatch, timbangan elektrik Mettler Toledo ® , Beker glass, gelas ukur, labu ukur, batang pengaduk, cawan porselin, kain flanel, pemanas.

2. Peralatan penetapan kadar air serbuk biji Persea americana Mill.

Moisture balance Halogen moisture analyser Mettler Toledo ® , sendok.

3. Peralatan uji nefroprotektif

Peralatan gelas, seperti Beker glass, labu ukur, batang pengaduk, gelas ukur, tabung reaksi, timbangan elektrik Mettler Toledo ® , pipa kapiler, tabung Eppendorf, spuit injeksi per oral dan syringe 3mL dan 5 mL Terumo ® , spuit injeksi intra peritonial dan syringe 1 mL Terumo ® , stopwatch, vortex Genie Wilten ® , sentrifuge Centurion Scientific ® , mikro pipet, Mikro vitalab 200 Merck ® , pinset, jarum pentul.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi serbuk biji Persea americana Mill.

Determinasi biji Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri serbuk Persea americana Mill. yang diperoleh dari Padang dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang dibuat dari contoh otentik. Determinasi serbuk biji dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang meliputi uji organoleptis serbuk, dan ciri-ciri mikroskopis serbuk biji Perseae americana Mill.yang digunakan dengan serbuk biji Persea americana Mill. pembanding.

2. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah sebuk biji Perseae americana Mill. yang diperoleh dari Padang, Sumatra Barat pada bulan Januari 2013.

3. Penetapan kadar air serbuk biji Perseae americana Mill

Penetapan kadar air dapat dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance. Sebanyak kurang lebih 5 g serbuk biji Persea americana Mill dimasukkan dalam alat moisture balance dan diratakan. Serbuk ditimbang dan dihitung sebagai bobot sebelum pemanasan. Serbuk kemudian dipanaskan pada suhu 105 C selama 15 menit. Serbuk kemudian ditimbang dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan. Selisih bobot sebelum dan setelah pemanasan merupakan kadar air sampel yang diteliti.

4. Pembuatan dekok biji Persea americana Mill.

Sebuk kering biji Persea americana Mill. ditimbang sebanyak 8,0 g. Serbuk kering kemudian dibasahi dengan 16,0 mL aquadest Depkes, 1986 selanjutnya ditambahkan aquadest sebanyak 100,0 mL. Campuran serbuk dan air dipanaskan dalam panci enamel pada suhu 90 C dan dijaga tetap dalam suhu tersebut selama 30 menit. Waktu 30 menit terhitung ketika suhu campuran mencapai 90 C. Setelah 30 menit, campuran tersebut disaring dengan menggunakan kain flanel dan diperas. Filtrat kemudian dihitung volumenya dan apabila tidak mencapai volume 100 mL ditambahkan dengan aquadest hingga 100 mL dengan menggunakan labu ukur.

5. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50

Berdasarkan penelitian Janakat dan Merie 2002, larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dimana perbandingan volume karbon tetraklorida dan pelarut adalah 1:1. Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan cara dilarutkan dalam volume yang sama dengan olive oil.

6. Uji pendahuluan a. Penetapan dosis nefrotoksik karbon tetraklorida

Dosis nefrotoksik ditentukan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Moneim and Khadragy 2012. Berdasarkan penelitian dosis kabon tetraklorida 2 mLkgBB secara intraperitonial dapat menyebabkan kerusakan sel-sel ginjal pada tikus yang ditunjukkan dengan adanya peningkatan kadar kreatinin tetapi tidak menyebabkan kematian pada tikus tersebut.

b. Penetapan waktu cuplikan darah

Penetapan waktu cuplikan darah ditentukan dengan melakukan orientasi empat kelompok perlakuan waktu. Orientasi dilakukan dengan menggunakan 4 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Tikus kemudian dilakukan pengambilan darah masing- masing pada jam ke-0, 24, 48, dan 72 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian dilakukan pengukuran kadar kreatinin.

7. Pengelompokan hewan uji

Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam 6 kelompok perlakukan masing-masing sebanyak lima ekor tikus. a. Kelompok I kontrol nefrotoksin yang diberikan larutan karbon tetraklorida-olive oil 1:1 dosis 2 mLkgBB secara i.p. b. Kelompok II kontrol negatif diberikan olive oil dosis 2 mLkg BB secara i.p. c. Kelompok III kontrol dekok diberikan dekok biji Persea americana Mill. dosis 360,71mg kgBB secara per oral. Pada jam ke- 6 setelah pemberian dekok biji Persea americana Mill. dilakukan pengambilan darah melalui sinus orbitalis mata untuk dilakukan penetapan kadar kreatinin dan dilakukan pengambilan organ ginjal tikus untuk melihat gambaran histologi ginjal. d. Kelompok IV-VI kelompok perlakuan diberikan dekok biji Persea americana Mill. dosis 360,71mgkgBB, kemudian secara berturut- turut pada jam ke-1, 4, dan 6 jam setelah pemberian dekok, diberikan dosis nefrotoksin karbon tetraklorida 2 mLkgBB. Pada jam ke-48 setelah pemerian karbon tetraklorida, kelompok I, II, IV, V, dan VI dilakukan pengambilan darah melalui sinus orbitalis mata untuk dilakukan penetapan kadar kreatinin dan dilakukan pengambilan organ ginjal tikus untuk melihat gambaran histologi ginjal.

8. Pembuatan serum

Darah yang telah diambil melalui sinus orbitalis mata tikus ditampung dalam tabung Eppendorf dan didiamkan selama 15 menit. Darah kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm dan diambil bagian supernatannya untuk dilakukan analisis.

9. Penetapan kadar kreatinin

Micro vitalab 200 digunakan untuk pengukuran kadar kreatinin. Sebelum dilakukan pengukuran sampel, alat divalidasi dengan menggunakan kontrol serum. Kisaran nilai kreatinin serum kontrol yaitu 1,09-1,71 mgdL. a. Penetapan kadar serum kontrol. Analisis dilakukan dengan mencampur 50 µL serum kontrol ditambahkan 1000 µL reagen I. Kemudian campuran divorteks selama 5 detik dan didiamkan selama 2 menit. Campuran kemudian ditambah dengan reagen II sebanyak 250 µL, divortex selama 5 detik dan didiamkan selama 1 menit. Campuran kemudian diukur dengan menggunakan mikrovitalab 200.

b. Penetapan kadar serum kreatinin. Analisis dilakukan dengan

mencampur 50 µL serum kreatinin ditambahkan 1000 µL reagen I. Kemudian campuran divorteks selama 5 detik dan didiamkan selama 2 menit. Campuran kemudian ditambah dengan reagen II sebanyak 250 µL, divortex selama 5 detik dan didiamkan selama 1 menit. Campuran kemudian diukur dengan menggunakan mikrovitalab 200.

10. Pembuatan preparat histologi tikus

Ginjal tikus diambil dengan menggunakan pisau skalpel, kemudian dimasukkan dalam formalin 10. Selanjutnya dilakukan pembuatan preparat histologis di Laboratorium Patologi Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas kreatinin diuji dengan metode Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data dan analisis varian untuk melihat kehomogenitasan varian antar kelompok sebagai syarat analisis parametik. Data kemudian dianalisis dengan analisis variansi pola searah one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna signifikan p ≤ 0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Analisis yang digunakan untuk 2 kelompok dilakukan dengan metode Kolmogorov- Smirnov untuk mengetahui distribusi data dan analisis varian untuk melihat kehomogenitasan varian antar kelompok sebagai syarat analisis parametik. Apabila hasil menunjukkan distribusi normal maka dilanjutkan dengan t-test berpasangan untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok bermakna signifikan p ≤ 0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p 0,05. Perhitungan persen efek nefroprotektif terhadap nefrotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus : � � � � 4 − � � � � − � � � − � � � � � � � � 4 − � � � � � 100 41

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian dekok biji Persea americana Mill. sebagai nefroprotektor pada tikus terinduksi karbon tetraklorida dengan pemberian jangka pendek. Untuk mencapai tujuan penelitian tersebut maka dilakukan beberapa pengujian.

A. Penyiapan Bahan 1.

Hasil determinasi serbuk biji tanaman Pada penelitian ini digunakan serbuk biji Persea americana Mill. sebagai bahan uji. Tujuan dilakukannya determinasi tanaman yaitu membuktikan bahwa bagian dari tanaman yang digunakan benar-benar berasal dari biji tanaman Persea americana Mill. sehingga nantinya tidak terjadi kesalahan dalam menyiapkan bahan yang digunakan. Proses determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri serbuk biji Persea americana Mill. yang dibuat dari contoh otentik dengan serbuk biji Persea americana Mill. yang diperoleh dari Padang, baik organoleptis maupun secara mikroskopis. Hasil determinasi membuktikan bahwa benar serbuk biji tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah Persea americana Mill. Lampiran 1..

2. Penetapan kadar air serbuk kering biji Persea americana Mill.

Penetapan kadar air bertujuan untuk mengetahui kandungan air dalam serbuk biji Persea americana Mill. Melalui uji ini dapat diketahui apakah serbuk biji Persea americana Mill. telah memenuhi persyaratan serbuk yang baik,