14 GFPuv dapat dihitung secara in vivo dan in vitro melalui berbagai teknik dengan mikroskop
fluoresens, flow cytometry, dan spektroflorometri Chalfie et al. 1994.
Gambar 7. Struktur tiga dimensi GFPuv Tansila et al. 2007
E. PLASMID GREEN FLUORESCENT PROTEIN pGFPuv
Plasmid merupakan elemen ekstrakromosomal yang secara fisik terpisah dari kromosom sel inang dan mampu bertahan dengan stabil pada kondisi tersebut Clowes 1972. Plasmid dapat
bereplikasi secara independen dari kromosom sel inang dan diwariskan secara stabil. Seperti halnya kromosom, plasmid memiliki struktur sirkular dan superkoil, meskipun ada beberapa plasmid yang
strukturnya linier. Perbedaan plasmid dengan kromosom inang adalah plasmid memiliki ukuran yang kecil dan dapat menyandikan gen yang sebenarnya tidak esensial bagi ketahanan bakteri. Hal ini
berarti kondisi tidak adanya plasmid tidak akan membunuh bakteri, tetapi keberadaan plasmid dapat memberikan keuntungan tambahan bagi sel bakteri tersebut. Plasmid dapat berpindah ke sel lain, tapi
tidak semua plasmid dapat berpindah. Hanya plasmid yang memiliki gen untuk perpindahan diri yang dapat berpindah. Plasmid memiliki 2 karakteristik penting, yaitu kemampuannya untuk melakukan
replikasi dan membagi dirinya ketika sel inang membelah. Terkadang plasmid dikatakan hilang ketika sel keturunannya tidak menerima plasmid. Kehilangan plasmid dalam populasi tersebut menunjukkan
terjadinya pemisahan plasmid Rao 2012. Nurjanah et al. 2012 telah melakukan transformasi melalui penyisipan pGFPuv pada isolat
Cronobacter spp. YR t2a Meutia 2008, FWH c3 Hamdani 2012, dan DES c7 Gitapratiwi 2011 yang kemudian digunakan pada penelitian ini. Plasmid GFPuv tersebut diperoleh dari Clontech
Laboratories, Inc USA. Plasmid ini mengandung gen yang menyandikan GFP Aequorea victoria yang telah dioptimalkan untuk intensitas fluoresens yang lebih tinggi ketika tereksitasi oleh sinar
ultraviolet UV standar 360-400 nm. Sekuens penyandi GFPuv diapit oleh 5’MCS dan 3’MCS, sehingga gen GFPuv dapat dipisahkan dari pGFpuv. Gen GFPuv disisipkan pada frame dengan kodon
inisiasi lacZ dari pUC19 sehingga protein gabungan β-galactosidase-GFPuv diekpresikan dari lac-
promoter pada E.coli. Gen Amp
r
menyandikan protein β-lactamase yang dapat mendegradasi
antibiotik ampisilin sehingga memiliki sifat resisten terhadap ampisilin. Sekuens pUC menyediakan jumlah sandian yang tinggi dari replikasi dan gen resisten ampisilin dalam perbanyakan pada E.coli.
Perbanyakan plasmid pada E. coli direkomendasikan untuk dilakukan pada isolat JM109 atau DH5 α.
Untuk memperoleh penanda terseleksi, plasmid menunjukkan sifat resisten terhadap ampisilin dengan
15 konsentrasi 100 µgml pada sel inang E. coli Clontech, USA. Gambar plasmid GFPuv dapat dilihat
pada Gambar 8.
Gambar 8. Peta vektor pGFPuv Clontech, USA
F. MEKANISME MUTASI MELALUI TRANSFORMASI
