12 1975. Ampisilin dapat dirusak oleh penicillinase dan diinaktivasi oleh S. aureus dan galur-galur
tertentu Proteus spp. dan Klebsiella spp. yang memproduksi penicillinase. Ampisilin tahan terhadap asam dan dapat diserap dengan baik pada saluran pencernaan Kennedy et al. 1963.
D. GREEN FLUORESCENT PROTEIN
Green Fluorescent Protein GFP pertama kali ditemukan oleh Shimomura et al. 1962 sebagai protein pendamping aequorin yang merupakan protein chemiluminescent dari ubur-ubur laut
Aequorea victoria. GFP merupakan polipeptida yang terdiri dari 238 asam amino yang membentuk barrel padat dengan bobot molekul 27 kDa. Barrel tersebut terdiri dari 11 antiparalel
β-strands yang diuntai oleh
α-heliks yang memanjang pada sumbu silinder. Kromofor tertempel pada α-heliks dan tersimpan dalam pada pusat geometrik molekul, yang disebut dengan
β-can Tsien 1998. Struktur tiga dimensi GFP dapat dilihat pada Gambar 5. Struktur
α-heliks ditunjukkan oleh warna merah, β- strand ditunjukkan oleh warna hijau, dan kromofor ditunjukkan oleh model ball-and-stick Brejc et al.
1997. Bagian yang bertanggung jawab terhadap karakteristik fluoresens GFP terletak di dalam barrel yang menyediakan lingkungan yang baik bagi kromofor untuk berpendar. Kromofor terdiri dari residu
tiga asam amino, yaitu Serin-65, Tirosin-66, Glisin-67 yang membentuk struktur imidazole Heim et al. 1994.
Gambar 5. Struktur tiga dimensi GFP Brejc et al. 1997 Pembentukan kromofor fluoresens secara utuh terjadi secara bertahap. Tahap pertama yaitu
GFP melakukan pelipatan. Pada tahap kedua, cincin imidazole dibentuk melalui siklikasi residu Serin- 65 dan Glisin-67 yang diikuti dengan dehidrasi. Tahap terakhir yaitu molekul oksigen mengoksidasi
senyawa antara siklisasi pada residu Tirosin-66 untuk memebentuk struktur kromofor fluoresens p- hydroxybenzylideneimidazolinone. Mekanisme biosintesis kromofor GFP dapat dilihat pada Gambar
6. Setiap tahap dari pembentukan kromofor bersifat autokatalitik atau menggunakan faktor yang bersifat ada dimana-mana sehingga ekspresi fluoresens GFP memiliki spektrum yang luas untuk
berbagai organisme Chalfie dan Kain 2006; Kay dan Sullivan 1999; Tsien 1998. GFP ini dapat mengemisikan cahaya hijau 508 nm ketika tereksitasi oleh cahaya ultraviolet 395 nm Bongaerts et
al. 2002.
13 Gambar 6. Mekanisme biosintesis kromofor GFP Tsien 1998.
Selain pada Aequorea, GFP juga telah ditemukan pada Coelenterata hydrozoa seperti Obelia dan Phialidium, serta anthozoa seperti Renilla Morin dan Hastings 1971; Ward 1979. Akan tetapi,
hanya gen GFP dari Aequorea yang telah diklon untuk berbagai keperluan. Penanda GFP telah banyak dimanfaatkan karena sel tunggal bakteri yang telah tersisipi GFP dapat dideteksi dengan
menggunakan mikroskop epifluoresens sehingga posisi riil bakteri tersebut di alam dapat diketahui Ramos et al. 2000. Selain itu, gen GFP diketahui tahan terhadap beberapa senyawa denaturan dan
protease, serta tahan terhadap suhu yang tinggi 65 C dan perlakuan formaldehid. Gen GFP juga
masih dapat dideteksi pada preparat yang telah difiksasi Errampalli et al. 1999. GFPuv merupakan mutan yang dikembangkan melalui mutasi titik di tiga kodon asam amino
pada sekuens DNA GFP asli Crameri et al. 1996. Seperti halnya GFP, GFPuv memiliki eksitasi maksimum pada panjang gelombang 395 nm dan emisi maksimum pada 509 nm. Apabila
dibandingkan dengan GFP, GFPuv mengalami substitusi 3 asam amino, yaitu Phenilalanin-99 menjadi Serin, Metionin-153 menjadi Threonin, dan Valin-163 menjadi Alanin, namun tidak merubah sekuens
kromofor. Kelebihan GFPuv dibandingkan dengan GFP adalah intensitas pendaran yang lebih tinggi ketika tereksitasi oleh sinar ultraviolet UV pada panjang gelombang 395 nm. GFPuv dapat
berpendar 18 kali lipat dari GFP dan dapat dideteksi lebih mudah dengan mata tanpa memerlukan peralatan khusus Chin et al. 2003.
GFPuv bersifat resisten terhadap perubahan pH. Denaturasi secara lengkap hanya terjadi pada pH ekstrem 1.0 dan 4.0. GFPuv kehilangan sekitar 37 pendarannya pada pH 4.0 dan 15 pada pH
7.0. Ketahanannya terhadap perubahan pH paling utama disebabkan oleh struktur kromofor GFPuv yang terlindungi Chin et al. 2003. GFPuv mempunyai struktur yang hampir sama dengan GFP.
Perbedaannya yaitu adanya jarak yang cukup renggang antara β-strand ketujuh dan kedelapan yang
terbentuk selama pelipatan β-barrel pada GFPuv seperti yang terlihat pada Gambar 7 Tansila et al.
2007. Hal ini disebabkan proses mutasi yang terjadi berperan dalam mengurangi sifat hidrofobik GFP sehingga mengurangi agregasi dan memengaruhi kinetika pelipatan Hsu et al. 2009. Perubahan
intensitas fluoresens dapat terjadi karena protonasi dan deprotonasi residu yang berada di sekitar kromofor Kneen 1998. Oleh sebab itu, GFPuv cocok untuk digunakan dalam berbagai aplikasi
intraseluler, seperti penanda kuantitatif dari ekspresi gen Chin et al. 2003. Dengan stabilitas termalnya, GFPuv berpotensi sebagai indikator biologis fluoresens untuk menguji keefektifan
perlakuan panas pada suhu kurang dari 100 C Penna et al. 2004. Karakteristik fluoresens dari
14 GFPuv dapat dihitung secara in vivo dan in vitro melalui berbagai teknik dengan mikroskop
fluoresens, flow cytometry, dan spektroflorometri Chalfie et al. 1994.
Gambar 7. Struktur tiga dimensi GFPuv Tansila et al. 2007
E. PLASMID GREEN FLUORESCENT PROTEIN pGFPuv