kemudian dioven pada suhu 50
o
C selama 24 jam sampai cukup kering untuk diserbuk. Pada penelitian ini, yang diteliti adalah kulit jeruk nipis tanpa minyak
atsiri yang terkandung dalam kulit tersebut, sehingga metode pengeringan dengan menggunakan panas oven yang dapat menghilangkan kandungan minyak atsiri
pada kulit jeruk nipis tidak menjadi masalah. Kulit yang telah kering dan rapuh dihaluskan dengan mesin penyerbuk. Tujuan dari penyerbukan ini adalah untuk
memperkecil ukuran permukaan sampel uji sehingga luas kontak antara sampel dan penyari akan semakin besar dan proses penyarian akan lebih optimum.
Kemudian serbuk kulit jeruk dilewatkan ayakan dengan no.mesh 40 agar ukuran partikel serbuk homogen.
D. Ekstraksi Sampel
Ekstraksi yang dipilih untuk penelitian ini adalah maserasi. Metode maserasi memiliki beberapa kelebihan di antara metode ekstraksi lainnya. Selain
dapat menjaga stabilitas senyawa fenolik yang terekstraksi dari sampel, metode ini juga menguntungkan karena sederhana dan mudah dilakukan. Proses maserasi
dilakukan dengan melarutkan sampel ke dalam cairan penyari. Larutan penyari yang digunakan yaitu etanol 70 . Cairan penyari etanol 70 ini dipilih karena
senyawa-senyawa flavonoid mudah larut di dalam pelarut metanol maupun etanol yang mengandung air 20-50 Bruneton, 1999 dan proses maserasi ini dibantu
dengan alat shaker. Penggunaan shaker pada proses maserasi bertujuan untuk membantu agar hasil ekstraksi lebih maksimal dan efektif. Adanya bantuan
kinetik dari shaker akan membantu penyari untuk kontak langsung dan
berpenetrasi ke dalam sel-sel tanaman. Proses maserasi ini dilakukan selama tiga hari. Selanjutnya cairan penyari dipisahkan dari ampas serbuk kulit jeruk dengan
disaring. Penyaringan ini menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dan dibantu dengan pompa vakum. Pompa vakum digunakan untuk
membantu mempercepat proses penyaringan. Ampas hasil penyarian kemudian diremaserasi lagi dengan menambahkan penyari etanol yang baru dengan volume
yang sama selama tiga hari seperti sebelumnya. Dan hasil remaserasi dipisahkan dengan penyarinya dengan disaring menggunakan corong Buchner. Tujuan dari
remaserasi ini yaitu untuk menyari senyawa-senyawa yang mungkin belum sempat terekstraksi karena penyari yang sudah jenuh.
Hasil maserasi dan remaserasi digabung menjadi satu dan diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum rotary evaporator. Prinsip dari alat ini yaitu
penguapan dengan penurunan tekanan. Jika tekanan uap suatu cairan sama dengan tekanan atmosfer, maka cairan akan mendidih dan menguap pada titik didih
normalnya. Oleh sebab itu, dengan adanya vakum akan menurunkan tekanan pada alat di bawah tekanan atmosfer sehingga menyebabkan suatu cairan mendidih di
bawah titik didih normalnya. Penguapan pelarut dengan menggunakan rotary evaporator
direkomendasikan untuk residu yang tidak tahan panas karena temperatur pada penangas air pada rotary evaporator lebih rendah jika dibanding
pada penangas air biasa Patiram, Brajendra Azad Thakur dan Ramesh, 2007. Setelah itu, proses penguapan pelarut ini dilanjutkan dengan menggunakan oven
pada suhu 50
o
C untuk menghilangkan sisa-sisa penyari sampai diperoleh ekstrak etanol kulit jeruk nipis pada bobot tetap.
Ekstrak etanol kulit jeruk yang didapat kemudian dilarutkan dalam air hangat karena ekstrak sulit untuk dilarutkan dalam air dingin. Ekstrak yang telah
larut kemudian diektraksi cair-cair dengan wash bensin dengan perbandingan wash
bensin : air 1:1 vv menggunakan corong pisah. Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau clean-up sampel untuk
memisahkan analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit Gandjar, 2007. Prinsip dari ekstraksi
cair-cair merupakan pemisahan dua atau lebih senyawa yang saling campur berdasarkan perbedaan polaritas dengan menggunakan dua pelarut yang memiliki
perbedaan polaritas yang tidak saling campur. Analit-analit yang mudah terekstraksi ke pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang bersifat non-
polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa polar dan juga senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air. Pada partisi ini,
fraksi air akan berada di bagian bawah dan wash bensin di atas. Hal ini dikarenakan bobot jenis air 0,996 gml lebih besar jika dibandingkan dengan
wash bensin 0,730 gml. Bagian yang polar seperti polifenol dan flavonoid akan
terlarut ke dalam air, sedangkan bagian non polar seperti klorofil dan lipid akan terlarut ke dalam wash bensin. Proses ekstraksi ini dilakukan berulang sampai tiga
kali sampai pelarut wash bensin menjadi bening yang menandakan bahwa tidak ada lagi senyawa-senyawa yang tidak diinginkan yang terlarut di dalam fraksi air.
Fraksi yang diambil pada partisi ini adalah fraksi air yang mengandung polifenol dan flavonoid, sedangkan fraksi wash bensin tidak digunakan karena senyawa-
senyawa yang terlarut bukan merupakan senyawa yang ingin diuji dalam penelitian ini.
Setelah itu, proses partisi dilanjutkan kembali menggunakan pelarut yang berbeda, yaitu etil asetat yang berbobot jenis 0,898 gml dengan perbandingan
volume 1:1 vv. Pada partisi ini, etil asetat berada di atas karena bobot jenis air lebih besar 0,996 gml dibandingkan etil asetat. Proses ekstraksi ini juga
dilakukan berulang, yakni tiga kali sampai pelarut etil asetat menjadi bening. Hal ini menandakan bahwa tidak ada lagi senyawa yang larut dalam pelarut etil asetat.
Pada proses partisi ini, fraksi yang diambil adalah fraksi etil asetat karena sebagian besar senyawa-senyawa flavonoid larut dalam fraksi etil asetat.
Fraksi etil asetat yang didapat, dievaporasi menggunakan vacuum rotary evaporator
untuk menghilangkan pelarut. Kemudian dioven untuk menguapkan sisa-sisa etil asetat sampai didapat bobot tetap fraksi etil asetat ekstrak etanolik.
Fraksi etil asetat ini yang akan digunakan untuk uji aktivitas antioksidan dan ditetapkan kandungan fenolik total yang dinyatakan sebagai ekivalen asam galat.
Berat fraksi etil asetat yang didapat yaitu 245 mg dan disimpan dalam eksikator untuk menjaga stabilitas senyawa dari pengaruh cahaya maupun kelembaban
lingkungan.
E. Uji Pendahuluan
