trietilasetat = 2 : 2 : 1. Setelah itu bahan tersebut dikeringkan dengan pompa vakum bertekanan 50 Torr 3x.
c Derivatisasi Larutan derivat methanol : trimetilasetat : penilisotiosianat = 7 : 1 : 1.
Ditambahkan sebanyak 30 µ
l ke dalam contoh yang telah dikeringkan. Kemudian dibiarkan ± 20 menit, lalu dikeringkan dengan pompa vakum bertekanan 50 Torr.
Setelah itu, contoh yang telah kering diencerkan dengan 200 µ
l larutan pengencer Na-asetat 1M, sehingga diperoleh larutan contoh yang siap dianalisis.
d Analisis asam amino dengan alat HPLC Kondisi alat HPLC pada saat dilakukan analisis :
1. Temperatur kolom : 38
o
C 2. Kolo m : Pico tag 3,9 x 150 nm coulomb
3. Kecepatan alir : 1,5 mlmenit 4. Batas tekanan : 3000 psi
5. Program : Gradient 6. Fase gerak : - Asetonitril 60
- Buffer Natrium Asetat 1 M 7. Detektor : UV
8. Panjang gelombang : 254 nm Untuk analisis kuantitatif dapat dihitung dengan cara :
Keterangan :
C = Konsentrasi LA = Luas area
Fp = Faktor pengenceran BM = Bobot molekul Lampiran 3
3.3.4 Ekstraksi senyawa antibakteri ikan laut dalam
Senyawa antibakteri dari ikan laut dalam diperoleh dengan cara mengekstrak daging ikan laut dalam. Metode ekstraksi yang dilakukan pada
penelitian ini mengikuti metode Quinn 1988 diacu dalam Darusman et al. Asam amino
contoh Bobot
x BM
x Fp
x dar
s C
x dar
s LA
sampel LA
100 tan
tan =
1995 yang telah dimodifikasi. Sebelum proses ekstraksi dimulai, ikan laut dalam disiangi, dicuci dan diambil bagian dagingnya. Daging ikan dipotong
dihaluskan dengan mortar. Beberapa gram daging ikan ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Masing-
masing sampel daging ikan kemudian dicampur pelarut dengan perbandingan pelarut dan sampel daging ikan 2:1. Pelarut pertama yang digunakan adalah
kloroform. Kemudian sampel dimaserasi selama 24 jam untuk memastikan senyawa antibakteri yang terdapat pada daging ikan laut dalam terlarut dalam
pelarut. Selama proses ekstraksi, bagian atas erlenmeyer ditutup dengan kertas alumunium foil untuk mencegah terjadinya penguapan senyawa volatil dari bahan.
Setelah 24 jam, sampel disaring dengan menggunakan kertas saring whatman untuk memisahkan filtrat dengan ampasnya sehingga diperoleh filtrat dan ampas
pertama. Ampas pertama dimaserasi lagi dengan pelarut etil asetat selama 24 jam, disaring dan diperoleh filtrat dan ampas kedua. Ampas kedua dimaserasi lagi
dengan pelarut metanol selama 24 jam, disaring dan diperolah filtrat dan ampas ketiga.
Kemudian filtrat I, II dan III dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator
suhu 40
o
C diperoleh ekstrak kasar kloroform, etil asetat dan metanol. Diagram alir ekstraksi senyawa bioaktif dapat dilihat pada Gambar 4.
3.3.5 Uji senyawa antibakteri
• Persiapan media cair Lauria Broth
Media cair Lauria Broth digunakan untuk menyegarkan bakteri yang akan diuji. Komposisi media cair yang digunakan terdiri dari : tryp ton 1 gram,
yeast extract 0,5 gram dan NaCl 1 gram yang semuanya dilarutkan dalam 100 ml
akuades dengan pH 7,0. Media tersebut dihomogenkan dengan menggunakan hotplate
pada suhu 100
o
C sampai mendidih dan dipipet 10 ml ke dalam tabung reaksi. Tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas dan kasa. Kasa
digunakan untuk mengikat kapas agar tetap menyatu. Media tersebut kemudian disterilisasi pada 121
o
C selama 15 menit. Media didinginkan pada suhu ruang. Sebanyak 1 ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair yang dilakukan di
laminer dalam keadaan aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C.
Daging ikan
Penghancuran
Penimbangan
Ektraksi 24 jam Maserasi dengan kloroform
Penyaringan
Penyaringan Ektraksi 24 jam
Maserasi dengan etil asetat
Penyaringan Evaporasi
Evaporasi Ektraksi 24 jam
Maserasi dengan metanol Evaporasi
Filtrat
Ekstrak I Filtrat
Ekstrak II
Ekstrak III Filtrat
Ampas
Ampas Ampas
Gambar 4. Diagram alir proses ekstraksi senyawa bioaktif daging ikan laut dalam metode Quinn, 1988, diacu dalam Darusman et al.,
1995.
• Persiapan media padat Lauria Agar
Media padat yang digunakan dalam uji antibakteri adalah media Lauria Agar
. Komposisi media padat yang digunakan terdiri dari: tryp ton 1 gram, yeast extract
0,5 gram, NaCl 1 gram dan agar 1,8 gram yang semuanya dilarutkan dalam 100 ml akuades denga n pH 7,0. Media tersebut dihomogenkan dengan
menggunakan hotplate pada suhu 100
o
C sampai mendidih dan dipipet 15 ml ke dalam tabung reaksi. Tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas dan kasa.
Kasa digunakan untuk mengikat kapas agar tetap menyatu. Media tersebut kemudian disterilisasi pada 121
o
C selama 15 menit. Media didinginkan pada suhu ruang.
• Uji Aktifitas Senyawa Antibakteri
Uji aktivitas senyawa antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar Bauer et al., 1966, diacu dalam Jamal et al., 2003. Bakteri uji Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli dengan optical density OD
600
masing- masing 0,540 dan 0,620 diambil sebanyak 20 µl kemudian dipipet kedalam media Lauria agar.
Media tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan dituangkan ke dalam cawan steril dalam kondisi aseptik. Media dalam cawan digoyang secara
perlahan supaya merata dan dibiarkan mengeras. Kemudian media dibekukan dalam refrigerator selama ± 30 menit dalam posisi cawan terbalik.
Sebanyak 20 µ l larutan ekstrak diteteskan pada kertas cakram steril dan dibiarkan sampai terserap. Kemudian kertas cakram diletakkan di atas media
yang telah membeku sambil sedikit ditekan dengan menggunakan pinset. Besarnya konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 100 µgml, 200 µgml,
300 µgml, 600 µgml dan 700 µgml disesuaikan dengan jumlah rendemen ekstrak masing- masing ikan laut dalam yang diperoleh. Hal ini dilakukan untuk
memperoleh konsentrasi maksimal dari masing- masing jumlah ekstrak daging ikan laut dalam yang akan diuji ada tidaknya kandungan senyawa antibakteri.
Sebagai kontrol, digunakan kloramfenikol dengan konsentrasi 1 µgml. Media disimpan kembali dalam refrigerator selama 30 menit dengan posisi
terbalik. Selanjutnya, media diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 12-18 jam dengan posisi cawan dalam keadaan terbalik. Pengamatan dilakukan dengan
mengukur zona bening di sekitar kertas cakram. Daya hambat ekstrak dapat
Bakteri 20 µl dimasukkan ke dalam 15 ml media agar
Kertas cakram diberi ekstrak 20 µl dengan masing- masing
konsentrasi 100 µgml, 200 µgml, 300 µgml, 600 µgml,
dan 700 µgml.
Inkubasi pada suhu 37
o
C selama 12-18 jam dalam posisi cawan
terbalik Kertas cakram diletakkan di atas
media agar yang berisi bakteri dalam cawan petri
Pendinginan dalam refrigerator selama 30 menit
Pendinginan dalam laminer Media + bakteri dimasukkan ke
dalam cawan petri Homogenisasi
Pendinginan dalam refrigerator selama 30 menit
Pengamatan dan pengukuran zona bening
diukur dengan mengurangi diameter zona bening yang terbentuk dikurangi diameter kertas cakram. Diagram alur uji aktifitas senyawa antibakteri dapat
dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Diagram alir proses penentuan aktifitas antibakteri pada berbagai ekstrak daging ikan laut dalam Bauer et al., 1966,
diacu dalam Jamal et al., 2003.
3.3.6 Uji toksisitas
