Perbedaan Dan Hubungan Ekspresi VEGF Antara Tumor Ovarium Ganas Dan Jinak

(1)

PERBEDAAN DAN HUBUNGAN EKSPRESI VEGF

ANTARA TUMOR OVARI UM GANAS DAN JI NAK

TESIS

Oleh

ANINDITA NOVINA

DEPARTEMEN OBSTETRI DAN GINEKOLOGI

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

RSUP H.ADAM MALIK – RSUD DR.PIRNGADI MEDAN

(2)

PENELITIAN INI DIBAWAH BIMBINGAN TIM 5

Pembimbing : dr. Deri Edianto, M. Ked(OG), SpOG(K)

dr. Muhammad Rusda, M. Ked(OG), SpOG(K)

Penyanggah :dr. Ichwanul Adenin M. Ked(OG), SpOG(K)

Dr. dr. Sarma N. Lumbanraja M.Ked(OG), SpOG(K)

dr. Edy Ardiansyah, M. Ked(OG), SpOG(K)

Diajukan Untuk Melengkapi Tugas-tugas dan

Memenuhi Salah Satu Syarat Untuk Mencapai

Gelar Keahlian Dalam Program Studi

Obstetri dan Ginekologi

(3)

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Sumatera Utara, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : dr. Anindita Novina, M.Ked(OG) NIM : 097104017

Program Studi : Program Pendidikan Dokter Spesialis Konsentrasi : Obstetri Dan Ginekologi

Jenis Karya : Tesis

demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Sumatera Utara Hak Bebas Royalti Non-eksklusif (Non-exclusive Royalty Free Right ) atas tesis saya yang berjudul :

PERBEDAAN DAN HUBUNGAN EKSPRESI VEGF ANTARA TUMOR OVARIUM GANAS DAN JINAK

beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Non-eksklusif ini, Universitas Sumatera Utara berhak menyimpan, mengalihmedia/formatkan, mengelola dalam bentuk database, merawat dan mempublikasikan tesis saya tanpa meminta izin dari saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis dan sebagai pemilik hak cipta.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Medan

Pada Tanggal : 10 Oktober 2013 Yang menyatakan

(4)

(5)

KATA PENGANTAR

Dengan nama Allah Yang Maha Pengasih Lagi Maha Penyayang.

Segala puji dan syukur Saya panjatkan kepada Allah SWT, karena berkat rahmat dan hidayah-Nya penulisan tesis ini dapat diselesaikan.

Tesis ini disusun untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar keahlian dalam bidang Obstetri dan Ginekologi. Sebagai manusia biasa Saya menyadari bahwa tesis ini banyak kekurangannya dan masih jauh dari sempurna, namun demikian besar harapan Saya kiranya tesis ini dapat bermanfaat dalam menambah perbendaharaan bacaan khususnya tentang :

“

PERBEDAAN DAN HUBUNGAN EKSPRESI VEGF ANTARA TUMOR OVARIUM GANAS DAN JINAK”

Dengan selesainya laporan penelitian ini, perkenankanlah Saya menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat :

1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Syahril Pasaribu, DTM&H (CTM&H), SpA(K) dan Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Gontar Alamsyah Siregar, SpPD (KGEH), yang telah memberikan kesempatan kepada Saya untuk mengikuti Program Pendidikan Dokter Spesialis di Fakultas Kedokteran USU Medan

2. Ketua Departemen Obstetri dan Ginekologi FK-USU Medan, Prof. Dr. Delfi Lutan, MSc, SpOG (K); Sekretaris Departemen Obstetri dan Ginekologi FK-USU Medan, Dr. Dr. M. Fidel Ganis Siregar, M.Ked(OG), SpOG (K); Ketua Program Studi Dokter Spesialis Obstetri dan Ginekologi FK-USU Medan, dr. Henry Salim Siregar, SpOG (K); Sekretaris Program Studi Dokter Spesialis Obstetri dan Ginekologi FK-USU Medan, dr. M. Rhiza Z. Tala, M.Ked(OG), SpOG (K); Prof. dr. M. Jusuf Hanafiah, SpOG (K); Prof. Dr. Djafar Siddik, SpOG (K); Prof. Dr. dr. M. Thamrin Tanjung, SpOG (K); Prof. Dr. Hamonangan Hutapea, SpOG (K); Prof. dr. R.

(6)

Haryono Roeshadi, SpOG (K); Prof. dr. T. M. Hanafiah, SpOG (K); Prof. dr. Budi R. Hadibroto, SpOG (K); Prof. dr. M. Fauzie Sahil, SpOG(K); Prof. dr. Daulat H. Sibuea, SpOG (K); yang telah bersama-sama berkenan menerima Saya untuk mengikuti pendidikan di Departemen Obstetri dan Ginekologi.

3. Terima Kasih Yang sebesar-besarnya saya ucapkan kepada dr. Deri Edianto, M.Ked(OG), SpOG(K) dan dr. Muhammad Rusda M.Ked(OG), SpOG(K), selaku pembimbing tesis Saya, bersama dr. Ichwanul Adenin, M.Ked(OG), SpOG(K), Dr. dr. Sarma N. Lumbanraja, M.Ked(OG), SpOG(K), dan dr. Edy Ardiansyah, M.Ked(OG), SpOG(K), selaku pembanding dan nara sumber yang penuh dengan kesabaran telah meluangkan waktu yang sangat berharga untuk membimbing, memeriksa dan melengkapi penulisan tesis ini hingga selesai.

4. Prof. dr. M. Fauzie Sahil, SpOG(K) selaku Bapak Angkat Saya selama menjalani masa pendidikan, yang telah banyak mengayomi, membimbing dan memberikan nasehat yang bermanfaat kepada Saya selama dalam pendidikan.

5. dr. Putri C. Eyanoer, MSEpi, Phd sebagai pembimbing statistik yang telah banyak membantu Saya dalam penyelesaian tesis ini.

6. Seluruh Staf Pengajar Departemen Obstetri dan Ginekologi FK-USU Medan, yang secara langsung telah banyak membimbing dan mendidik Saya sejak awal hingga akhir pendidikan. Semoga Allah SWT membalas budi baik Guru-guru Saya tersebut.

7. dr. Christoffel L. Tobing, SpOG(K) dan dr. Herbert Sihite, SpOG, sebagai pembimbing tesis magister saya bersama dengan Prof. dr. Daulat H. Sibuea, SpOG(K), dr. Henry Salim Siregar, M.Ked(OG), SpOG(K) dan dr. Deri Edianto, M.Ked(OG), SpOG(K); selaku penyanggah dan narasumber dalam penulisan tesis magister Saya.

8. dr. Jamaluddin SpPA dan Ketua Departemen Patologi Anatomi FK-USU Medan beserta staf, atas kesempatan dan bimbingan yang telah diberikan selama Saya melakukan penelitian dan bertugas di Departemen tersebut.

(7)

9. Ketua Departemen Anestesiologi dan Reanimasi FK-USU Medan beserta staf, atas kesempatan dan bimbingan yang telah diberikan selama Saya bertugas di Departemen tersebut.

10. Direktur RSUP H. Adam Malik Medan yang telah memberikan kesempatan dan sarana kepada Saya selama mengikuti pendidikan di Departemen Obstetri dan Ginekologi.

11. Direktur RSUP dr. Pirngadi Medan, dr. Amran Lubis, SpJP; dan khususnya Kepala SMF Obstetri dan Ginekologi RSUD dr. Pirngadi Medan, dr. Syamsul Arifin Nasution, SpOG(K), beserta seluruh staf yang telah memberikan kesempatan dan sarana kepada Saya selama menempuh pendidikan di Departemen Obstetri dan Ginekologi.

12. Direktur Rumkit Tk. II Puteri Hijau KESDAM II/BB Medan, dr. Gunawan Rusuldi, SpOG, dr. Yazim Yaqub, SpOG, dr. Agnes D. H, SpOG(K) dan dr. Santa M.J.S, SpOG yang telah memberi kesempatan dan sarana serta bimbingan selama Saya bertugas di Rumah Sakit tersebut.

13. Direktur Rumah Sakit Umum PTPN II Tembakau Deli; dr. Sofyan Abdul Ilah, SpOG dan dr. Nazaruddin Jaffar, SpOG (K) beserta staf yang telah memberikan kesempatan dan bimbingan selama Saya bertugas menjalani pendidikan di Rumah Sakit tersebut.

14. Direktur RSU Haji Medan dan Kepala SMF Obstetri dan Ginekologi RSU Haji Medan dr. Muslich Perangin-angin, SpOG beserta staf yang telah memberi kesempatan dan sarana serta bimbingan kepada Saya selama bertugas di Rumah Sakit tersebut.

15. Direktur RSU Sundari Medan dan Kepala SMF Obstetri dan Gnekologi RSU Sundari Medan dr. H. M. Haidir, MHA, SpOG dan Ibu Sundari, Am.Keb beserta staf yang telah memberi kesempatan dan bimbingan selama Saya bertugas di Rumah Sakit tersebut.

16. Direktur RSUD Kab. Padang Lawas beserta staf yang telah memberikan kesempatan untuk bekerja dan sarana selama Saya bertugas di Rumah Sakit tersebut.

17. Kepada senior-senior Saya, dr. Ilham Sejahtera L., SpOG; dr. Nur Aflah, SpOG; dr. Yusmardi, SpOG; dr. Gorga W. U., SpOG; dr. Siti S. Sylvia,

(8)

SpOG; dr. Anggia M. L., SpOG; dr. Maya Hasmita, SpOG; dr. David Luther, SKM, Mked(OG), SpOG; dr. Riza H. Nasution, SpOG; dr. Lili Kuswani, SpOG; dr. M. Ikhwan, SpOG; dr. Edward Muldjadi, SpOG; dr. Ari Abdurrahman Lubis, SpOG; dr. Zilliyadein R., SpOG; dr. Benny J., SpOG; dr. M. Rizki Yaznil, Mked(OG), SpOG; dr. Yuri Andriansyah, SpOG; dr. T. Jeffrey A., SpOG; dr. Made S. Kumara, SpOG; dr. Sri Jauharah L., SpOG; dr. M. Jusuf R., Mked(OG), SpOG; dr. Boy P. Siregar, SpOG; dr. Hedy Tan, dr. G. Joshimin F, dr. Firman A, SpOG; dr. Aidil A., SpOG; dr. Rizka H., SpOG; dr. Hatsari, SpOG; dr. Andri P. Aswar, SpOG; dr. Alfian, SpOG; dr. Errol, SpOG; dr. T. Johan A., Mked(OG) , SpOG; dr. Tigor P. H., Mked(OG), SpOG; dr. Elvira M.S., Mked(OG), SpOG; dr. Hendry A.S., Mked(OG), SpOG; dr. Heika NS, Mked(OG), SpOG; dr. Riske E.P.; dr. Ali Akbar, Mked(OG), SpOG; dr. Arjuna S, Mked(OG), SpOG; dr. Janwar S, Mked(OG), SpOG; dr. Irwansyah P, Mked(OG), SpOG; dr. Ulfah W.K., Mked(OG), SpOG; dr. Ismail Usman, Mked(OG), SpOG; dan dr. Aries M., dr. Hendri Ginting, Mked(OG) SpOG; dr. Robby Pakpahan; dr. Meity Elvina, Mked(OG) SpOG; dr. M. Yusuf, Mked(OG) SpOG; dr. Dany Aryani, Mked(OG) SpOG; dr. Fatin Atifa, Mked(OG) SpOG; dr. Pantas S Siburian; dr. Morel Sembiring; dr. Sri Damayana H., Mked(OG); dr. Eka Handayani, Mked(OG); dr. Liza Marosa; dr. M Rizki P. Yudha; dr. Arief Siregar; dr. Ferdiansyah Putra Hrp Mked(OG); dr. Yudha Sudewo dan dr. Henry Gunawan, Saya berterima kasih atas segala bimbingan, bantuan dan dukungannya yang telah diberikan selama ini.

18. Kepada sahabat-sahabat saya sejawat angkatan: dr. Ika Sulaika; dr. Edy Rizaldy; dr. Hotbin P; dr. Kiko M; dr. Edward S M; dr Abdurrohim L; dr. Edwin E.H; dr. M. Rizal S; dr. Ricca PR; dr. Julita A; dr. M. Wahyu W; dr. Novrial; dr. Nureliani Amni; dr. Ivo FC; dr. Ray C.B; dr. Fifianti P.A; dr. Hiro H.N.; terima kasih untuk kebersamaan dan kerjasamanya selama pendidikan hingga saat ini.

19. Kepada semua rekan rekan PPDS yang pernah bekerjasama dengan saya dalam tim jaga maupun dalam kegiatan pendidikan. Terima kasih

(9)

atas kebersamaan kita selama ini, kenangan indah akan Saya ingat selamanya.

20. Kepada almh. Ibu Hj. Asnawati Hsb, Ibu Hj. Sosmalawaty, Ibu Zubaedah, Mimi, Kak Asih, Kak Yus, Fina, Anggi, Dewi dan seluruh Pegawai di lingkungan Departemen Obstetri dan Ginekologi RSUP H. Adam Malik Medan terima kasih atas bantuan dan dukungannya.

21. Dokter muda, Bidan, Paramedis, karyawan/karyawati, serta para pasien di Departemen Obstetri dan Ginekologi FK-USU/RSUP. H. Adam Malik-RSUD dr. Pirngadi Medan, RS. Haji Medan, RS. Sundari yang dari padanya Saya banyak memperoleh pengetahuan baru, terima kasih atas kerja sama dan saling pengertian yang diberikan kepada Saya sehingga dapat sampai pada akhir program pendidikan ini.

Tiada kata yang dapat Saya ucapkan selain rasa syukur kepada Allah SWT dan sembah sujud serta terima kasih yang tidak terhingga Saya sampaikan kepada kedua orangtua Saya yang sangat Saya cintai, Ayahanda dr. H. Einil Rizar, SpOG(K) dan ibunda Hj. Dwi Satelita yang telah membesarkan, membimbing, mendoakan, serta mendidik Saya dengan penuh kesabaran dan kasih sayang dari sejak kecil hingga kini, memberi contoh yang baik dalam menjalani hidup serta memberikan motivasi dan semangat kepada Saya selama mengikuti pendidikan ini.

Kepada Ayah dan Ibu Mertua Saya; Bapak Drs. H. Thamrin Mardia dan Ibu Hj. Gusti N. Lintang, kepada Suami tercinta dr. Andri Iskandar Mardia dan adik-adik kami dr. M. Bayu Rizaldy; Andara Livia, S.T; dr. Indra K. Mardia, dr. Martua Mardia; Intan S. Mardia dan Rina S Mardia yang merupakan inspirasi dan pendorong motivasi Saya dalam menyelesaikan pendidikan saya selama ini. Semoga ilmu yang saya peroleh dapat memberikan manfaat kepada kita semua.

Akhirnya kepada seluruh keluarga handai tolan yang tidak dapat Saya sebutkan namanya satu persatu, baik secara langsung maupun tidak langsung, yang telah

(10)

banyak memberikan bantuan, baik moril maupun materil, Saya ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya.

Semoga Allah SWT senantiasa memberikan rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Amin Ya Rabbal ‘Alamin.

Medan, 10 Oktober 2013

dr. Anindita Novina, M.Ked(OG)

(11)

DAFTAR ISI

Halaman Halaman Pernyataan Persetujuan Publikasi Karya Ilmiah Untuk

Kepentingan Akademis ... i

Kata Pengantar ... ii

Daftar Isi ... vii

Daftar Gambar ... ix

Daftar Tabel ... ix

Daftar Singkatan ... x

Abstrak ... xi

Abstract ... xii

BAB I PENDAHULUAN 1 1.1. Latar Belakang Penelitian ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 3

1.3. Tujuan Penelitian ... 4

1.4. Manfaat Penelitian ... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 5 2.1. Kanker Ovarium ... 5

2.2. Angiogenesis pada tumor ovarium ... 7

2.3. Aktivator dan penghambat angiogenesis... 2.4. Famili VEGF... 2.4.1. VEGF A ... 2.4.2. VEGF B ... 2.4.3. VEGF C ... 2.4.4. VEGF D ... 2.4.5. VEGF E ... 2.4.6. PIGF ... 2.5. Reseptor VEGF ... 2.5.1. VEGFR 1 ... 2.5.2. VEGFR 2 ... 11 15 16 17 17 18 19 19 20 21 22

(12)

2.5.4. Neurophilin-1 dan -2 ... 2.6. VEGF Sebagai Faktor Pro Angiogenik ... 2.7. Regulasi VEGF ... 2.7.1 Hipoksia ... ... 2.7.2 Growth factors dan sitokin inflamasi ... 2.7.3 Hormon ... 2.7.4 Onco-genes dan tumor suppressor ganas ... 2.8. Ekspresi kuat VEGF ... 2.9. Terapi antiangiogenik ... 2.9.1 Bevazicumab ...

23 24 26 26 28 30 31 32 34 35 2.9.2 VEGF Trap (Aflibercept)...

2.9.3 Inhibitor Reseptor Tyrosine Kinase... 2.10. Kerangka teori ...

36 37 39

BAB III Kerangka konsep dan hipotesis ... 40

3.1. Kerangka konsep ... 40

3.2. Hipotesis ... 41

BAB IV Metode Penelitian ... 42

4.1. Rancangan penelitian ... 42

4.2. Tempat dan waktu penelitian ... 42 4.3. Populasi penelitian ...

4.3.1 Populasi target ... 4.3.2 Populasi terjangkau ... 4.4. Sampel dan besar sampel ... 4.4.1 Sampel ... 4.4.2 Besar sampel ... 4.5. Kriteria inklusi dan eksklusi ... 4.5.1 Kriteria inklusi ... 4.5.2 Kriteria eksklusi ... 4.6 Prosedur pemeriksaan imunohistokimia ... 4.6.1 Alat penelitian ... 4.6.2 Bahan penelitian ... 4.6.3 Cara kerja ...

42 42 42 43 43 43 44 44 44 44 44 44 45

(13)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

2.1. Mekanisme neovaskularisasi tumor ... 10 2.2. VEGF sebagai mediator angiogenesis dan faktor-faktor yang

mempengaruhi ekspresi VEGF ...

2.3. Berbagai pendekatan targeted therapy ... 34

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

2.1. Faktor pro-angiogenik endogen ... 12 2.2. Faktor anti-angiogenik ... 14 4.1. Histocore VEGF untuk penilaian imunohistokimia ... 47 5.1.

5.2. 5.3.

5.4.

Distribusi karakteristik pasien dengan tumor ovarium ... Distribusi hasil histopatologi tumor ovarium jinak dan ganas.. Perbedaan rerata skor ekspresi VEGF antara tumor ovarium ganas dan jinak ... Hubungan antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas ...

52 55

57 4.6.4 Instrumen penilaian ...

4.7. Definisi operasional ... 4.8. Alur penelitian ... 4.9. Analisis data ...

47 48 51 51 BAB V BAB VI DAFTAR Lampiran

Hasil dan Pembahasan ... Kesimpulan dan saran ... PUSTAKA ...

52 60 61

(14)

DAFTAR SINGKATAN

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VPF : Vascular Permeability Factor

FGF : Fibroblast Growth Factor

mRNA : messenger Ribonucleatide Acid

VEGFR : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor PIGF : Placenta Growth Factor

Flk-1/KDR : Fetal liver kinase-1/Kinase Domain-containing Receptor

uPA : urokinase-type Plasminogen Activator TTPA : Tissue-Type Plasminogen Activator FAK : Focal Adhesion Kinase

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase PI3K : Phosphoinositol-3 Kinase

XIAP : X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein EPO : Erythropoietin Glycoprotein

HIF-1 : Hypoxia inducible factor-1 TNF-α : Tumor Necrosis Factor-alpha PAF : Platelet Activating Factor TGF-β : Tissue Growth Factor-beta EGF : Epidermal Growth Factor PDGF : Platelet-Derived Growth factor

IL : Interleukin

MDGF : Macrophage-Derived Growth Factor IgG : Immunoglobulin G

(15)

TKls : Tyrosine kinases

RSUP : Rumah Sakit Umum Pusat DAB : Diaminobenzidine

(16)

Abstrak

PERBEDAAN DAN HUBUNGAN EKSPRESI VEGF ANTARA TUMOR OVARIUM GANAS DAN JINAK

Novina A, Edianto D, Rusda M, Adenin I, Lumbanraja S N, Ardiansyah E

Tujuan : Untuk mengetahui gambaran karakteristik pasien dengan tumor ovarium ganas dan jinak, jenis histopatologi, serta perbedaan dan hubungan ekspresi VEGF antara kasus-kasus tumor ovarium ganas dan jinak

Metode : Melalui pemilihan secara acak sederhana diperoleh 25 pasien yang memenuhi kriteria penelitian pada masing-masing kelompok tumor ovarium ganas dan jinak. Penelitian dilakukan dengan melihat catatan rekam medis dan menilai ekspresi VEGF sel tumor dari blok parafin pada pemeriksaan imunohistokimia.

Hasil : Berdasarkan usia, penderita tumor ovarium jinak maupun ganas terbanyak adalah kelompok usia ≥ 40 tahun, namun uji t menunjukkan terdapat perbedaan rerata usia yang bermakna antara kedua kelompok (P=0.033; 95% Cl, -14.161 - -0.639). Karakteristik lain yang terbanyak adalah usia menarche ≥10 tahun, sudah menopause dan memiliki paritas ≥1. Tidak terdapat perbedaan antara kedua kelompok berdasarkan usia menarche, status menopause dan paritas. Jenis histopatologi terbanyak adalah Adenocarcinoma serosum (32%). Tumor ovarium ganas paling banyak menunjukkan ekspresi kuat VEGF (skor 3-6); rata-rata skor 3,44±SD2,103 sedangkan tumor ovarium jinak kebanyakan menunjukkan ekspresi lemah (skor 0-2); rata-rata skor 0,92±SD1,222. Terdapat perbedaan bermakna antara kedua kelompok berdasarkan ekspresi VEGF (P=0.000;95%Cl,-3.498 - -1.542). Dijumpai hubungan bermakna antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas (P=0.000), dimana 60% tumor ovarium ganas menunjukkan ekspresi kuat VEGF, sedangkan hanya 8% kasus tumor ovarium jinak yang menunjukkan ekspresi kuat VEGF.

Kesimpulan : Terdapat perbedaan bermakna antara kelompok penderita tumor ovarium jinak dan ganas berdasarkan rata-rata usia, sedangkan tidak dijumpai perbedaan antara kedua kelompok berdasarkan usia menarche, status menopause dan paritas. Jenis histologi serosum merupakan yang terbanyak ditemukan. Terdapat perbedaan ekspresi VEGF antara tumor ovarium ganas dan jinak. Ekspresi kuat VEGF berhubungan dengan kejadian tumor ovarium ganas.

(17)

Kata kunci : tumor ovarium ganas, tumor ovarium jinak, ekspresi VEGF, imunohistokimia.

Abstract

DIFFERENCES AND ASSOCIATION OF VEGF EXPRESSION BETWEEN MALIGNANT AND BENIGN OVARIAN TUMORS

Novina A, Edianto D, Rusda M, Adenin I, Lumbanraja S N, Ardiansyah E

Objective: To describe the characteristics of patients with malignant and benign ovarian tumors, histopatological types, as well as VEGF expression differences and association between malignant ovarian tumors and benign ovarian tumors cases.

Methods: Through simple random sampling 25 patients who met study criteria were obtained for each group of malignant and benign ovarian tumors. Research was done by collecting data from medical records and assessing VEGF expression of tumor cells derived from paraffin blocks on immunohistochemical examination

Results : Based on ages, patients with benign or malignant ovarian tumors are most ≥40 years old, but the t test results showed significant differences on mean age between the groups (P = 0.0033). Most other characteristics are menarche age ≥10 years old, menopause and have parity ≥1. T test results showed no difference between the two groups based on menarche age, menopausal status, and parity. The most histological type was Adenocarcinoma serosum (32%). Most malignant ovarian tumors showed strong expression of VEGF (score 3-6) with mean score of 3.44±SD2,103 whereas most benign ovarian tumors showed significant differences between the two groups based on the expression of VEGF (P=0.000;95%Cl,-3.498 - -1.542). Significant association was found between strong expression of VEGF with the incidence of malignant ovarian tumors (P=0.000), which 60% of malignant ovarian tumors showed strong expression of VEGF.

Conclusion: There are significant differences between groups of patients with benign and malignant ovarian tumors based on mean age, whereas no significant differences was found between the two groups based on age of menarche, menopausal status, and parity. Serosum histological type was the most frequently encountered. There are differences of VEGF expression between malignant and benign ovarian tumors. Strong expression of VEGF is associated to malignant ovarian tumor incidence.

(18)

Abstrak

PERBEDAAN DAN HUBUNGAN EKSPRESI VEGF ANTARA TUMOR OVARIUM GANAS DAN JINAK

Novina A, Edianto D, Rusda M, Adenin I, Lumbanraja S N, Ardiansyah E

(19)

Kata kunci : tumor ovarium ganas, tumor ovarium jinak, ekspresi VEGF, imunohistokimia.

Abstract

DIFFERENCES AND ASSOCIATION OF VEGF EXPRESSION BETWEEN MALIGNANT AND BENIGN OVARIAN TUMORS

Novina A, Edianto D, Rusda M, Adenin I, Lumbanraja S N, Ardiansyah E

(20)

Keywords: malignant ovarian tumors, benign ovarian tumors, VEGF expression, immunohistochemical

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kanker ovarium merupakan keganasan ginekologi yang paling banyak menyebabkan kematian. Jalur umum perkembangan tumor pada kanker ovarium adalah penyebaran peritoneal, dan akumulasi progresif asites sering terjadi dengan atau tanpa sel tumor ganas dalam cairan peritoneal. Penyebaran dalam kavum peritoneal berhubungan dengan gejala klinis non spesifik yang sering disalah diagnosa dengan gangguan gastrointestinal atau kelainan genitalia interna lainnya. Beberapa gejala yang umum adalah rasa tidak nyaman dan penuh di perut. Masalah lainnya adalah sulit untuk mempalpasi massa di ovarium yang masih berada di rongga pelvis. Oleh karena alasan-alasan tersebut, sekitar 70% pasien baru terdiagnosa ketika kanker ovarium telah mencapai stadium III atau IV.

Sekitar 90 sampai 95 persen dari semua kasus kanker ovarium terdiri dari karsinoma ovarium epitel. Penanganan kanker ovarium epitel didasarkan pada kombinasi pembedahan dan kemoterapi. Debulking massa tumor diikuti kemoterapi berbasis platinum telah menjadi standar penanganan kanker ovarium epitel stadium lanjut. Meskipun penanganan primer yang agresif memberikan tingkat respon yang baik, kebanyakan penderita kanker ovarium stadium lanjut akan mengalami kekambuhan dan resistensi terhadap kemoterapi. Hal ini

(21)

menunjukkan kebutuhan dikembangkannya strategi baru dan agen terapi yang lebih baik.

Ketergantungan pertumbuhan tumor dan metastasis terhadap aliran pembuluh darah menjadikan angiogenesis sebagai target terapi yang rasional. Angiogenesis sendiri adalah tolak ukur dari kesembuhan luka, siklus menstruasi, kanker, dan berbagai iskemia serta penyakit inflamasi. Ketika mencapai ukuran diameter sekitar 2.0 mm, tumor menjadi hipoksia dan memulai angiogenesis. Berbagai molekul pro dan antiangiogenik telah ditemukan. Vascular Endothelial

Growth Factor (VEGF) merupakan pencetus angiogenesis dan

limphangiogenesis yang cukup menarik dan banyak dipelajari. Transduksi sinyal mencakup ikatan dengan reseptor tyrosine kinase dan menghasilkan proliferasi sel endotelial, migrasi dan juga pembentukan pembuluh darah baru.

1,3

VEGF yang juga dikenal sebagai vascular permeability factor (VPF), adalah sitokin multifungsi yang meningkatkan permeabilitas mikrovaskuler dan secara langsung merangsang pertumbuhan sel endotel dan angiogenesis, dimana reseptor spesifik untuk VEGF diekspresikan dalam sel endotel vaskular. VEGF disintesis dan disekresi oleh berbagai sel tumor hasil kultur dan tumor solid pada manusia, seperti tumor otak, kanker paru-paru, kanker payudara, adenocarcinoma saluran pencernaan, ginjal dan kandung kemih serta kanker ovarium. Peningkatan ekspresi VEGF dianggap terlibat dalam tumorigenesis, metastasis dan produksi efusi melalui peningkatan permeabilitas pembuluh darah atau angiogenesis, sehingga banyak dilakukan penelitian untuk mendukung penggunaan anti VEGF.

2,5

(22)

Apakah tingkat ekspresi VEGF berbeda bermakna antara tumor ovarium jinak dan kanker ovarium sehingga dapat mendukung penggunaan anti VEGF pada kasus kanker ovarium, masih belum jelas. Oleh karena itu muncul pertanyaan penelitian adakah perbedaan ekspresi VEGF pada kasus kanker ovarium dan tumor ovarium jinak melalui pemeriksaan imunohistokimia pada jaringan ovarium yang telah diparafinisasi.

1.2. Rumusan masalah

- Apakah terdapat perbedaan ekspresi VEGF pada kasus tumor ovarium ganas dibandingkan pada tumor ovarium jinak?

- Apakah terdapat hubungan antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas?

1.3. Tujuan

1.3.1. Tujuan Umum

Mengetahui perbedaan dan hubungan ekspresi VEGF antara kasus – kasus tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Mengetahui distribusi frekuensi pasien dengan tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak berdasarkan usia

2. Mengetahui distribusi frekuensi pasien dengan tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak berdasarkan status menopause

3. Mengetahui distribusi frekuensi pasien dengan tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak berdasarkan usia menarche

4. Mengetahui distribusi frekuensi pasien dengan tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak berdasarkan status paritas

(23)

5. Mengetahui distribusi frekuensi pasien dengan tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak berdasarkan jenis histopatologi tumor ovarium

6. Mengetahui perbedaan ekspresi VEGF pada kasus tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak

7. Mengetahui hubungan antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas

1.4. Manfaat

1. Memberikan informasi mengenai ekspresi VEGF yang ditemukan pada kasus – kasus tumor ovarium

2. Menjadi pedoman / pertimbangan pemberian antiangiogenesis pada penatalaksanaan tumor ovarium ganas

(24)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kanker Ovarium

Tumor ovarium adalah temuan yang sering dijumpai dalam praktik ginekologi. Kebanyakan dari tumor ovarium adalah neoplasma dan umumnya bersifat jinak. Namun, kanker ovarium merupakan penyebab kematian akibat kanker organ reproduksi yang paling sering dijumpai. Di seluruh dunia setiap tahunnya, sebanyak 204.000 wanita didiagnosa dengan kanker ovarium, dan sebanyak 125.000 wanita meninggal akibat penyakit ini. Pada tahun 2009,

American Cancer Society melaporkan kanker ovarium sebagai keganasan

ginekologi dengan kasus kematian tertinggi dimana dari 21.550 kasus kanker ovarium epitel dijumpai 14.600 kematian terkait penyakit tersebut. Angka kematian yang tinggi ini terutama disebabkan tidak timbulnya gejala pada stadium dini dan mayoritas dari pasien (75%) datang pada stadium lanjut, dengan penyakit metastasis luas dalam rongga peritoneal.

Tumor ovarium terbagi atas tiga kelompok berdasarkan struktur anatomi dari mana tumor itu berasal yaitu tumor epitel ovarium, tumor sel germinal, dan tumor sex cord stromal. Kanker ovarium yang berasal dari epitel merupakan kasus yang terbanyak yaitu meliputi 90-95%, sisanya sekitar 5-10% berasal dari sel germinal dan sex cord stromal.

1,8

Seperti kanker payudara, insidensi kanker ovarium meningkat seiring usia dengan mayoritas pada usia 40-60 tahun. Pada penelitian Fa¨rkkila et al. (2011), dari 106 subyek penelitian, rerata usia saat diagnosis kanker ovarium adalah 51,5 tahun (rentang 19-87 tahun) dan 60 pasien (57%) sudah menopause

(25)

sedangkan 46 pasien (43%) belum menopause saat didiagnosa.Dari penelitian Duncan et al. (2005) pada 339 pasien dengan kanker ovarium primer, rerata usia saat diagnosis adalah 61 tahun (rentang 24 – 90 tahun). Sedangkan pada penelitian Alvarez et al. (1999) yang melibatkan 88 pasien kanker ovarium, dijumpai rerata usia pasien 58 tahun (rentang 26-81).

Selain usia, banyak faktor resiko kanker ovarium terkait dengan teori “incessant ovulation”, meliputi infertilitas, nuliparitas, peningkatan jumlah siklus ovulasi, menarche dini dan menopause lanjut. Stimulasi ovarium yang berkepanjangan oleh gonadotropin dan trauma serta penyembuhan berulang karena ovulasi atau inflamasi diduga berperan sebagai etiologi kanker ovarium.

8,9,10,11,12,13

Faktor resiko lain terkait kanker ovarium adalah riwayat keluarga dengan kanker payudara atau ovarium. Diperkirakan 5-10% kanker ovarium epitel disebabkan pewarisan mutasi germline pada gen predisposisi kanker,

6,10,14

dimana gen BRCA 1 dan BRCA2 dikaitkan dengan kanker payudara dan ovarium. BRCA1 maupun BRCA2 merupakan gen supresor tumor. Gen BRCA1 terletak pada kromosom 17q21, pasien dengan mutasi gen ini terbukti memiliki peningkatan resiko terjadi kanker payudara (60-85 %) dan kanker ovarium (20– 40%). BRCA2 terletak di kromosom 13q12, mutasi gen ini juga mengarah pada peningkatan resiko kanker payudara (60-85%) dan kanker ovarium (10-20%). Hal ini menyebabkan peningkatan permintaan untuk konseling dan pemeriksaan genetis.

2.2 Angiogenesis pada Kanker Ovarium

(26)

Pertumbuhan tumor ganas dan kemampuan metastasis, keduanya telah terbukti sangat tergantung pada angiogenesis, atau pembentukan pembuluh darah baru. Neovaskularisasi diperlukan oleh tumor untuk menyediakan nutrisi dan oksigen yang tidak dapat dipenuhi melalui difusi sederhana agar memungkinkan pertumbuhan tumor >2 mm. Baik tumor dan jaringan penjamu menghasilkan berbagai faktor angiogenik yang mempromosikan migrasi sel endotel, biasanya dari venule pasca kapiler ke tumor, sehingga terjadi perkembangan pembuluh darah dari kapiler.

Neovaskularisasi atau pembentukan pembuluh darah baru dibedakan menjadi vaskulogenesis dan angiogenesis. Vaskulogenesis secara klasik merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang berasal dari hemangioblas yang berdiferensiasi menjadi sel darah dan sel endotel matur. Pada embrio dan yolk sac, pembuluh darah dini berkembang dari agregasi angioblas menjadi sambungan jaringan pembuluh endotel yang sederhana. Kemudian terjadi remodelling pembuluh darah primitif ini menjadi sistem sirkulasi yang fungsional. Pembuluh darah ini juga mengalami proliferasi dan regresi lokal serta pertumbuhan cabang dan migrasi.

6,16,17,18

16,17

Angiogenesis adalah proses pembentukan pembuluh darah baru yang berasal dari jaringan pembuluh darah yang telah ada sebelumnya dengan cara pembentukan capillary sprouting. Selama proses ini, sel endotel yang matur membelah dan menempel pada kapiler baru. Sinyal VEGF diperlukan pada vaskulogenesis dan angiogenesis.

Angiogenesis dimulai dari stimulasi endothelium, menghasilkan hiperpermeabilitas dari membran endotel dan degradasi membran basal dan

(27)

stroma di bawahnya. Langkah selanjutnya adalah migrasi dan proliferasi sel endotel, dan pembentukan pembuluh darah baru dan kapiler. Dua faktor penting dalam angiogenesis adalah fibroblast growth factor (b-FGF) dan vascular

endothelial growth factor (VEGF). VEGF ditemukan sebagai faktor yang

menimbulkan hiperpermeabilitas dan awalnya bernama vascular permeability

factor (VPF). Kebanyakan tumor mengekspresikan VEGF, termasuk kanker

ovarium, lambung dan usus. Peningkatan permeabilitas kapiler akibat produksi zat aktif lokal seperti VEGF, juga dapat menjadi faktor penting dalam patofisiologi asites pada keganasan.6,17,20,21

Angiogenesis klasik terdiri dari fase penonjolan pembuluh darah (sprouting vessel) dan fase resolusi. Fase sprouting terdiri dari enam komponen: (i) meningkatkan permeabilitas pembuluh darah dan deposisi fibrin ekstravaskuler, (ii) pembongkaran dinding pembuluh, (iii) degradasi basement membran, (iv) migrasi sel dan invasi matriks ekstraseluler, (v) proliferasi sel endotel, dan (vi) pembentukan lumen kapiler. Fase resolusi terdiri dari lima komponen: (i) penghambatan proliferasi sel endotel, (ii) penghentian migrasi sel, (iii) pemulihan basement membran, (iv) junctional pematangan kompleks, dan (v) perakitan dinding pembuluh termasuk perekrutan dan diferensiasi sel otot polos dan pericytes. Selain angiogenesis klasik, berbagai bentuk angiogenesis

nonsprouting turut berperan dalam perkembangan tumor, termasuk

pertumbuhan pembuluh darah intussusepsi, kooptasi, pembentukan pembuluh mosaik, dan mimikri vaskulogenik (gambar 2.1).

Pembuluh darah baru sering memiliki membran basal yang cacat dan berdinding tipis sehingga mudah bocor, menyediakan tempat dimana sejumlah

(28)

besar sel-sel kanker dapat memasuki sistem peredaran darah dan bermetastasis. Oleh karena itu proses angiogenik tidak hanya meningkatkan pertumbuhan tumor secara lokal tetapi memfasilitasi penyebaran sel tumor ke situs lain.3,17

Gambar 2.1. Mekanisme neovaskularisasi tumor. (A) Endothelial sprouting merupakan proses yang dominan pada pertumbuhan pembuluh darah. Lumen sel endotel bermigrasi disepanjang membran dasar pembuluh darah ke dalam matrix ekstrasel, berkembang menjadi pertumbuhan bentuk yang memanjang. (B) Mimikri vaskulogenik merupakan perkembangan saluran mikrovaskular oleh sel tumor. (C) Kooptasi pembuluh darah melibatkan penggunaan pembuluh darah yang telah ada pada host. (D) Proses neovaskularisasi tumor melibatkan pelepasan faktor proangiogenik seperti VEGF oleh sel tumor menyebabkan aktifasi endotel, pertumbuhan pembuluh darah dan meluasnya tumor.3

(29)

2.3 Aktivator dan penghambat angiogenesis

Pada manusia dewasa, sel-sel endotel sangat sedikit membelah, hanya 1 dari setiap 10.000 sel endotel pada satu siklus pembelahan sel. Namun, terdapat peningkatan mitosis sel endotel dan angiogenesis selama penyembuhan luka dan perbaikan jaringan, selama pembentukan korpus luteum ovarium, dan selama perkembangan plasenta pada kehamilan. Penghambatan angiogenesis merupakan terapi potensial untuk gangguan angiogenesis non-fisiologis termasuk degenerasi makula mata terkait usia, retinopati diabetes, endometriosis, psoriasis, arthritis, pertumbuhan tumor dan metastasis.

Angiogenesis merupakan sistem yang dikendalikan oleh faktor proangiogenik dan faktor antiangiogenik. Keseimbangan angiogenik adalah keseimbangan fisiologis antara sinyal stimulasi dan inhibisi pertumbuhan pembuluh darah. Terdapat sekitar 30 faktor endogen pro-angiogenik, beberapa tercantum dalam Tabel 2.1. Tiga famili regulator memegang peran penting dalam vaskulogenesis dan angiogenesis. Famili VEGF/VEGFR adalah famili regulator yang paling banyak dipelajari. Sistem angiopoietin mengendalikan maturasi pembuluh darah sementara sistem eph/Ephrin mengendalikan asimetri arterio-vena.

19,20

(30)

Tabel 2.1 Faktor pro-angiogenik endogen

Faktor MW (kDa)

Acidic Fibroblast Growth Factor (aFGF,FGF1)b Angiogenin

17,5

Angiopoeitin-1 57,5

16,6

Angiopoeitin-2 56,9

Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF2)b

Ephrin-A1 23,8

17,3

Ephrin-B1 38,0

Ephrin B2 36,9

Epidemial Growth Factor (EGF)b

Granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) 16,3

134

Macrophage-granulocyte colony-stimulating factor (GM –CSF) 16,3 Hepatic growth factor (HGF,Scatter factor)b

Interleukin-8 (II-8, CXCL8)

83,1

Leptin 18,6

11,1

Placental Growth Factor (PIGF)b

Platelet-derived endothelial growth factor (PD-EGF)

24,8

Platelet-derived growth factor-A (PDGF-A)

50,0

Platelet-dreived growth factor-B (PDGF –B)

24,0

Transforming growth factor-α ( TGF-α)

27,3

Transforming Growth Factor- ᵝ (TGF-ᵝ)

17,0

Tumor Necrosis Factor (TNF-α)

44,3

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A)

25,6 b VEGF-B 27,6 b VEGF-C 21,6 b VEGF-D 46,9 b 40,4 _a

Molecular weight (MW) corresponding to the unprocessed human precursor

(31)

Pada tabel 2.2 tercantum beberapa faktor anti-angiogenik dari sekitar 30 faktor endogen anti-angiogenik. Sebagai regulator negatif, anti-angiogenik yang paling banyak dipelajari meliputi angiostatin, endostatin, dan thrombospondin. Dalam kondisi yang fisiologis pada manusia dewasa, aksi regulator negatif mendominasi dan angiogenesis cenderung tidak terjadi. Dalam kondisi patologis tertentu, misalnya, selama perkembangan tumor, pembuluh darah mengalami apa yang disebut “angiogenic switch”, aksi regulator positif dominan dan angiogenesis menjadi aktif. Kaskade angiogenesis ini akan menimbulkan perubahan fenotip pada sel endotel pembuluh darah tumor sehingga memungkinkan tumor tumbuh cepat, menginvasi jaringan sekitarnya serta bermetastasis.18,20,22,23,24

(32)

Tabel 2.2 Faktor anti-angiogenik

Inhibitor MW (kDa)

(A) Derived from the extracellular matrix

Anestelin 263

Arresten 161

Canstatin 168

Chondromodulin-1 37,1

EFC-XV 142

Endorepellin 469

Endostatin 154

Fibulin Fragments ≈ 77

Thrombospondin-1 and -2 129

Tumstatin 162

(B) Non- Matrix derived factors

Angiostatin 90,6

Antithrombin III ( Cleaved) 52,6

Hemopexin-like domain (PEX) 73,9

Interferon-α, -ᵝ,-ᵞ ≈22

Interleukin-1, -4, -12,-18 ≈17

2-Methoxyestradiol

Pigment epithelium-derived factor (PEDF) 46,3

Plasminogen krimgle-5 90,6

Platelet factor-4 10,8

Prolactin Fragments 25,9

Prothrombin kringle-2 70,0

Semaphorin – 3F 88,4

Soluble VEGFR1 151

TIMP-2 24,4

Troponin-1 21,2

TrpRS 53,2

Vasostatin 48,1

(33)

2.4 Famili VEGF

VEGF merupakan sitokin multifungsi yang merangsang angiogenesis dan meningkatkan permeabilitas mikrovaskular melalui ikatan reseptor spesifik yang diekspresikan pada sel endotel vaskular. Yang termasuk ke dalam kelompok VEGF adalah VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF E dan Placental Growth Factor (PIGF). Setiap protein ini mengandung urutan sinyal yang membelah selama proses biosintesis.1,5,16,20,21,22,23,25

VEGF telah terbukti memiliki peran penting dalam pembentukan neovaskular pada tumor, menyediakan makanan bagi sel-sel tumor yang tinggi metabolismenya serta menyediakan akses ke pembuluh darah host. Penelitian telah menunjukkan peran dari VEGF dalam berbagai tahapan karsinogenesis ovarium, dengan efek pada pertumbuhan tumor dan neovaskularisasi terlihat pada model hewan dan pada manusia. Pada kanker ovarium stadium lanjut, VEGF menginduksi hiperpermeabilitas pembuluh darah peritoneum, selanjutnya terjadi hiperosmolaritas intraperitoneal yang disebabkan bocornya plasma protein. Hal ini akan menimbulkan asites.

Pada kanker ovarium stadium dini, peningkatan ekspresi VEGF berhubungan dengan massa bebas penyakit yang lebih singkat serta klinis yang lebih buruk. Kadar serum VEGF yang tinggi dianggap merupakan faktor resiko dan parameter prognostik terhadap metastasis, peningkatan stadium dan penurunan angka ketahanan hidup pada penderita kanker ovarium.

6,22,25,26

6,26,27

(34)

VEGF-A pada umumnya hanya disebut sebagai VEGF saja. Ditemukan pada akhir 1970-an, VEGF merupakan glikoprotein dimerik terikat disulfida dengan berat 34 hingga 42-kDa, dan mengandung lokasi N-linkage glycosylation, yang terdiri dari 9 isoform hasil dari splicing alternatif pre transkrip mRNA dari gen tunggal yang mengandung 8 akson. Beberapa isoform VEGF-A yang berperan dalam proses angiogenesis adalah VEGF 121, 145, 165, 183, 189 dan 206. 5,16,18,20,21,25

Ekspresi gen VEGF paling banyak diregulasi oleh keadaan hipoksia, hormon seks steroid dan beberapa sitokin. VEGF A mRNA pada keadaan normal dijumpai pada jaringan paru-paru, ginjal, jantung dan kelenjar adrenal. Kadar VEGF A dengan kadar yang rendah dapat terdeteksi di limpa, hati dan mukosa lambung. VEGF A mRNA diekspresikan secara luas pada keganasan payudara, kanker ovarium, kanker kolorektal, kanker paru-paru non small cell dan kanker prostat. Di antara seluruh anggota famili VEGF, VEGF A dianggap regulator yang paling penting dalam angiogenesis.

2.4.2 VEGF B

5,16,17,20,25

VEGF B ditemukan pada tahun 1995. VEGF B diekspresikan pada myocardium, otot skeletal dan pankreas. Gen VEGF B disusun oleh 7 exon. Splicing alternatif dari exon 6 menghasilkan 2 isoform VEGF B yaitu VEGF-B167 (21 kDa) dan VEGF-B186 (32 kDa). VEGF B167 strukturnya mirip dengan beberapa isoform VEGF A.

VEGF B berikatan dengan permukaan sel atau pericellular heparan

sulfate proteoglycans dimana VEGF B186 disekresikan secara bebas. VEGF-B

mRNA diekspresikan pada beberapa neoplasama pada manusia, meliputi 5,17,20

(35)

thymoma, karsinoma payudara, fibrosarkoma, lymphoma non-Hodgkins, dan melanoma. Oleh karena ekspresinya pada tumor dan kemampuannya mengaktifkan VEGFR1 dan neurophilin 1, VEGF B menjadi target yang potensial pada pengobatan kanker.17,20

2.4.3. VEGF C

Gen untuk VEGF-C menghabiskan rentang lebih dari 40 kB DNA dan terdiri dari tujuh exon. VEGF C disintesa sebagai prepro protein yang mengalami proteolitik untuk menghasilkan growth factor dalam bentuk yang matur. Dua prekursor VEGF C akan membentuk homodimer yang dihubungkan oleh ikatan disulfida dari setiap satu terminal C pada terminal propeptida N. Sebelum disekresi, dimer ini akan mengalami proteolisis. VEGF C dimerik yang matur mengandung 8 residu cysteine homolog.5,20,27

Pada manusia dewasa, VEGF-C lebih dominan pada jantung, plasenta, ovarium, usus kecil dan kelenjar tyroid. Bentuk VEGF C matur akan mengikat VEGFR2 dan VEGFR3 dan menjadi faktor penting pada lymphogenesis. Pada perkembangan pembuluh limfatik, adanya lymphedema disebabkan adanya defek pada VEGF C. Sinyal VEGF C diperlukan untuk migrasi dan bertahannya sel endotel pembuluh limfatik dan pembentukan kantung lymph. VEGF-C ikut berperan dalam limfangiogenesis selama embriogenesis dan dalam pemeliharaan diferensiasi endotel limfatik pada usia dewasa. Selain itu, VEGF-C diekspresikan dengan fraksi yang signifikan pada beberapa tumor termasuk kanker payudara, leher rahim, usus besar, paru-paru, prostat, lambung. Dengan demikian, VEGF-C merupakan target anti-kanker yang potensial.

(36)

2.4.4. VEGF-D

Seperti VEGF-C, VEGF-D disintesis sebagai prepro-protein yang mengalami proses proteolitik yang rumit untuk menghasilkan bentuk faktor pertumbuhan yang matur. VEGF-D yang matur merupakan homodimer non-kovalen. Meskipun dalam bentuk yang belum diolah, VEGF-D akan mengikat VEGFR3, hal ini penting dalam limfangiogenesis. Gen VEGF-D berisi tujuh ekson dan ditemukan pada kromosom X.

Jaringan usus, jantung, paru-paru, otot rangka, dan usus kecil menunjukkan transkrip VEGF-D yang tinggi sementara ovarium, pankreas, prostat, limpa, dan testis menunjukkan transkrip VEGF-D yang rendah. Regulasi VEGF-D meningkat pada karsinoma payudara, kolorektal, lambung, tiroid, neoplasia intraepitel serviks, glioblastoma, dan melanoma. Ekspresinya berkorelasi dengan metastasis kelenjar getah beningpada kanker kolorektal, paru-paru, dan ovarium. Sinyal VEGF-D memiliki potensi menjadi target anti-kanker dan antimetastasis.

5,20,26

20,23

2.4.5 VEGF E

VEGF-E adalah VEGF yang dikode oleh parapoxvirus Orf. VEGF-E berikatan dengan afinitas tinggi pada VEGFR2 tapi tidak dengan VEGFR1. Faktor ini terlibat dalam angiogenesis patologis pada lesi akibat infeksi parapoxvirus.5,20

(37)

Placenta Growth Factor merupakan glikoprotein homodimeric yang memiliki kemiripan urutan asam amino sebesar 42% dengan VEGF dan dapat meningkatkan sinyal VEGF. PlGF memiliki inti seperti kelompok VEGF yaitu terdiri dari delapan residu cystein yang turut dalam pembentukan ikatan disulfida antar-dan intra-subunit. Gen PlGF berisi tujuh ekson dan mengekspresikan empat isoform yaitu PlGF- 131, -152, -203, dan -224 berdasarkan splicing alternatif pra-mRNA. Transkrip isoform PlGF muncul terutama di plasenta. Ekspresi isoform PlGF yang berbeda-beda juga dapat dijumpai pada payudara, lambung, prostat, kanker paru-paru non small cell, jantung yang normal, otot skeletal, retina, dan kulit, namun PlGF hanya berikatan dengan VEGFR1.16,20,25

2.5 Reseptor VEGF

Tiga famili reseptor protein-tyrosine kinase memegang peran penting dalam vaskulogenesis dan angiogenesis. Tiga reseptor tirosin kinase VEGF afinitas tinggi telah diidentifikasi: VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (flk-1/KDR) dan VEGFR-3 (flt-4). Pengikatan reseptor VEGF ini memulai kaskade jalur sinyal yang memediasi migrasi, proliferasi, kelangsungan hidup dan permeabilitas sel endotel.5,19,20,22,23

VEGF-A berinteraksi dengan baik VEGFR-1 dan VEGFR-2 untuk memediasi angiogenesis, sedangkan VEGF-B dan PlGF memiliki afinitas tinggi hanya dengan VEGFR-1. VEGF-C dan VEGF-D mengikat baik VEGFR-2 dan VEGFR-3 untuk mengatur angiogenesis dan juga terlibat dalam limfangiogenesis. VEGFR-2 adalah reseptor utama yang mempromosikan efek pro-angiogenik VEGF-A dan menjadi target utama terapi anti-angiogenik,

(38)

meskipun studi tambahan telah menggarisbawahi pentingnya signaling melalui VEGFR-1.

Tambahan ko-reseptor termasuk neuropilin (neuropilin-1 dan -2), meningkatkan ikatan VEGF ke reseptornya. Namun, data terakhir menunjukkan bahwa neuropilin-1 dapat mempengaruhi fungsi sel endotel independen dari VEGFR-2, dan bahwa VEGF121 dapat langsung berinteraksi dengan neuropilin-1 tanpa membentuk kompleks NRP-neuropilin-1-VEGFR-2.

5,20,25,26

5,20,23

2.5.1. VEGFR1

VEGFR1 (Flt-1, fms-like tyrosyl kinase-1) berikatan dengan VEGF, PlGF dan VEGF B. VEGFR1 memiliki berat molekul sebesar 210 kDa. Gen VEGFR1 manusia, yang terdiri dari 30 ekson, berlokasi di kromosom 13q12. Alternatif splicing dari pre-mRNA VEGFR1 menghasilkan isoform reseptor yang larut (sVEGFR1) yang dapat mengikat dan menghambat kerja dari VEGF. VEGFR1 memiliki beberapa fungsi yang bergantung pada perkembangan stadium dan lokasi sel endotel yang memproduksi reseptor.

VEGF A memiliki afinitas yang lebih tinggi dengan VEGFR1 dari pada VEGFR2. VEGFR1 memiliki afinitas fosforilasi tirosine kinase yang lemah setelah perangsangan oleh VEGF.

20,22

Aktivasi VEGFR1 tidak memiliki efek langsung terhadap proliferasi, namun aktivasinya berdampak pada ekspresi

plasminogen activator pada sel endotel, dimana molekul ini berperan pada

degradasi matriks ekstraselular dan migrasi sel.20,25

PlGF ditemukan mengikat sampel sel endotel vena umbilicus manusia yang mengekspresikan VEGFR1 dan VEGFR2, dan menggantikan sebagian

(39)

kecil isoform VEGF-165 yang terikat. Hasil ini sesuai dengan anggapan bahwa PlGF hanya berikatan dengan VEGFR1. Potensiasi PlGF ini dianggap berkontribusi terhadap angiogenesis selama perkembangan tumor.20,25

2.5.2 VEGFR2 (Flk-1/KDR)

VEGFR2 (Flk-1/KDR, Fetal liver kinase-1/Kinase Domain-containing

Receptor) berikatan dengan VEGF dengan berat jenis molekul lebih rendah

(110-165 residu asam amino), VEGF-E, dan VEGF-C serta VEGF-D bentuk matur. VEGFR2, yang memiliki berat molekul berkisar 210 kDa, merupakan mediator dominan migrasi sel endotel, proliferasi, kelangsungan hidup, dan peningkatan permeabilitas pembuluh darah yang distimulasi VEGF. Meskipun VEGFR2 memiliki afinitas yang lebih rendah untuk VEGF dari pada VEGFR1, VEGFR2 menunjukkan aktivitas protein tyrosine-kinase terhadap ligandnya. VEGF merangsang terjadinya dimerisasi VEGFR2 yang menyebabkan autofosforilasi dan aktivasi reseptor.

2.5.3 VEGFR3 (Flt-4)

5,20

VEGFR 3 memiliki berat molekul 170kDa, memegang peranan penting dalam terjadinya remodelling primer pleksus kapiler pada embrio serta berperan pada angiogenesis dan limfangiogenesis pada manusia dewasa. Reseptor ini terdapat di dalam sel endotel pembuluh darah embrio dan produksinya menurun dan akhirnya terbatas pada pembuluh limfatik. Mutasi pada loop katalitik domain kinase VEGFR3 menyebabkan limfedema yang disebut sebagai Milroy’s disease yang ditandai dengan adanya pembengkakan pada ekstremitas disebabkan oleh kerusakan pembuluh limfatik. VEGFR3 mengalami pembelahan proteolitik pada

(40)

domain imunoglobulin ke 6 dengan 2 komponen rantai awal tetap berikatan dengan ikatan disulfida. Pada kultur stem cell embrio, hipoksia meningkatkan ekspresi VEGFR3.5,20

2.5.4 Neurophilin-1 dan -2

Neurophilin merupakan ko-reseptor transmembran non-protein-tyrosine kinase untuk kelompok semaphorin dan famili VEGF. Neurophilin juga berfungsi sebagai reseptor isoform VEGF secara terpisah dari VEGFR1, VEGFR2 atau VEGFR3. VEGF 165, PlGF 152 dan isoform VEGF B berikatan dengan Neurophilin 1. Sementara VEGF-145, VEGF-165, PlGF-152 dan VEGF-C berikatan dengan neurophilin 2. VEGF 121 bukan merupakan ligand baik pada neurophilin 1 dan 2.10,20

Neurophilin merupakan glikoprotein dengan komponen ekstra seluler yang besar, segmen transmembran, dan bagian intrasel yang pendek (≈40 residu asam amino). Walaupun bagian intra selnya terlalu kecil untuk berfungsi sebagai katalis, tetapi bagian intraselnya mungkin berfungsi sebagai tempat berkumpul sinyal molekul atau sebagai hubungan dengan ko-reseptor.

Neurophilin 1 terdapat pada neuron sensoris dan neuron simpatis, sedangkan neurophilin 2 terdapat pada neuron simpatis saja. Neurophilin 1 juga terdapat pada bermacam-macam tipe sel non neuronal dan non vaskular pada kondisi fisiologis termasuk pada fibroblas sumsum tulang, adiposa, sel imun dendritik, osteoblas, mesangial ginjal dan sel epitel golmerular ginjal.

5,20

(41)

VEGF bekerja pada sel endotel dengan memicu tiga aktivitas utama sel endotel dalam angiogenesis yaitu sekresi protease, migrasi dan proliferasi. Degradasi membran dasar dibutuhkan untuk migrasi dan invasi sel endotel. Hal ini merupakan langkah awal yang penting dalam memulai angiogenesis. VEGF menginduksi berbagai macam enzim dan protein yang penting untuk proses degradasi, termasuk matrix degrading meallpotroteinase, metalloproteinase interstitial collagenase, dan serin proteinase seperti urokinase-type plasminogen activator (uPA) dan tissue-type plasminogen activator (TTPA). Aktivasi enzim-enzim tersebut mengarah ke lingkungan yang prodegradasi yang memfasilitasi migrasi dan pertunasan sel endotel.

Mekanisme intraseluler dimana VEGF menyebabkan peningkatan migrasi sel endotel belum sepenuhnya dimengerti, tetapi tampaknya melibatkan sinyal yang berhubungan dengan Focal Adhesion Kinase (FAK) yang menyebabkan pergantian adhesi fokal dan organisasi filamen actin serta reorganisasi actin yang diinduksi MAPK (mitogen-activated protein kinase) p38. Sebagai tambahan telah diusulkan bahwa oksida nitrat juga berperan penting dalam migrasi sel endotel yang diindukasi VEGF. Oksida nitrat telah diimplikasikan dalam proses podokinesis sel endotel dan aktivasi sintase oksida nitrat endotel tergantung pada Akt yang dibutuhkan pada proses migrasi sel yang diinduksi VEGF.

20,22,25

VEGF mengaktivasi sel endotel dengan efek perubahan morfologi sel endotel, perubahan sitoskeleton, dan menstimulasi migrasi dan pertumbuhan sel endotel. VEGF bersifat mitogen terhadap sel endotel yang menyebabkan proliferasi sel. VEGF juga mempengaruhi faktor survival sel endotel dengan menghambat apoptosis. Pada penelitian invitro VEGF dijumpai menghambat

(42)

apoptosis dengan mengaktivasi jalur PI3K-Akt yang juga meningkatkan regulasi protein antiapoptotik seperti bcl-2 dan A1. Hal ini akan menghambat aktivasi caspase dan meningkatkan regulasi anggota famili penghambat apoptosis termasuk survivin dan XIAP. Dengan mengaktivasi FAK, VEGF juga mempertahankan sinyal survival sel-sel endotel. 9,20,25

2.7 Regulasi VEGF

Sinyal terhadap faktor proangiogenik terutama muncul sebagai respon terhadap hipoksia. Selain hipoksia, berbagai growth factor, hormon, onco-genes, dan tumor suppressor genes juga meregulasi ekspresi VEGF.5,16,18,24,25,28

2.7.1 Hipoksia

Dalam kondisi fisiogi yang normal, setiap 1014 sel pada tubuh manusia dewasa mendapat suplai oksigen yang cukup untuk memenuhi kebutuhan metabolik melalui fungsi sistem pulmonal, hematopoietik dan juga sistem kardiovaskular. Oksigen diangkut oleh eritrosit yang bersirkulasi, dikontrol oleh hormon glycoprotein erythropoietin (EPO). Sel yang menghasilan EPO dalam liver dan ginjal dapat mendeteksi konsentrasi oksigen untuk merespon hipoksia sistemik dengan meningkatkan transkripsi gen EPO.5

Hipoksia juga dapat terjadi terbatas pada tingkat sel di dalam organ spesifik, khususnya akibat perfusi yang tidak cukup. VEGF-A memainkan peran sentral dalam angiogenesis dan neovaskularisasi, meningkatan hantaran oksigen dan substrat energi. Ekspresi VEGF-A dapat dirangsang ketika sel mengalami hipoksia atau hipoglikemia. Respon ini tampaknya

(43)

tergantung pada elemen yang responsif terhadap hipoksia pada regio 5 dan 3 gen VEGF-A.

Hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) merupakan mediator utama

terhadap respon hipoksia tersebut. Kompleks protein HIF-1 yang diinduksi hipoksia berikatan dengan sekuensi enhancer dari gen VEGF-A. HIF-1 adalah heterodimer yang terdiri dari subunit HIF-1α dan HIF-1β. HIF-1α terdegradasi pada kondisi cukup oksigen melalui ubiquitinasi yang ditingkatkan oleh ikatan pada protein von Hippel Lindau dan p53. Kondisi hipoksia menghambat ubiquitinasi dan menstabilkan protein HIF-1α. HIF-1α akan mengalami dimerisasi dengan HIF-1β agar dapat stabil di dalam kompartemen nuklear. Kompleks ini kemudian akan berikatan serta mengaktivasi promoter VEGF-A dan menyebabkan peningkatan transkripsi VEGF.

5,25,28

(44)

2.7.2 Growth factors dan sitokin inflamasi

Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) adalah sitokin inflamasi dengan spektrum aktivitas biologi yang luas, termasuk dalam angiogenesis. TNF-α mempengaruhi pembentukan pembuluh darah baru secara tidak langsung. Pelepasan molekul angiogenik (seperti PAF, A dan VEGF-C) dan juga pengaturan sistem proteolitik (seperti uPA) merupakan kejadian biologis yang dipicu oleh TNF-α. Lebih lanjut, telah terbukti bahwa TNF-α juga meningkatkan transkripsi gen VEGFR-2 dalam sel endotelial vaskular. Hal ini tentu akan menjelaskan peningkatan dalam ekspresi VEGFR-2.5,18

Beberapa faktor pertumbuhan seperti tissue growth factor-β (TGF-β),

epidermal growth factor (EGF) dan platelet-derived growth factor (PDGF) menginduksi ekspresi mRNA VEGF-A. Sitokin seperti IL-1α pada fibroblast synovial manusia, IL-1β pada sel otot polos aorta dan IL-6 pada lini sel tumor telah memperlihatkan stimulasi ekspresi VEGF-A.

5,16

Salah satu kelainan ginekologi yang dihubungkan dengan keadaan inflamasi adalah endometriosis. Endometriosis adalah kelainan ginekologi yang paling sering ditemukan pada wanita usia reproduksi, dimana sekitar 10% wanita usia reproduksi didapati menderita endometriosis. Pada endometriosis, sejumlah besar leukosit direkrut dari sirkulasi darah ke dalam lesi endometriosis sehingga terjadi perubahan jumlah dan fungsi dari leukosit dalam cairan peritoneum dan juga dalam lesi endometriosis. Terdapat perubahan pada populasi sel T, sel B, sel mast, sel dendritik dan makrofag dalam lesi endometriosis ektopik yang mungkin diakibatkan oleh perubahan potensial pada sel T regulator yang mempengaruhi terjadinya endometriosis dan progresifitasnya.

(45)

Endometriosis juga ditandai dengan peningkatan volume cairan peritoneum, peningkatan konsentrasi sel darah putih cairan peritoneum (terutama makrofag) dan peningkatan sitokin inflamasi, faktor pertumbuhan, dan substansi penyokong angiogenesis. Makrofag dapat menyokong pertumbuhan sel-sel endometrium dengan cara mensekresi growth factor dan angiogenetic factor seperti Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), epidermal growth

factor (EGF), macrophage-derived growth factor (MDGF), fibronektin, dan

adhesion molecule seperti integrin. Setelah perlekatan sel-sel endometrium ke peritoneum, terjadi invasi dan pertumbuhan lebih lanjut yang tampaknya diregulasi oleh matrix metalloproteinase (MMP) dan inhibitor jaringannya.

Pada penelitian Bourlev et al. (2006) yang membandingkan antara wanita yang menderita endometriosis dengan wanita non-endometriosis, diketahui bahwa ekspresi VEGF-A lebih tinggi pada endometrium wanita dengan endometriosis. Ekspresi VEGFR-1 dan VEGFR-2 lebih rendah pada sel stroma dari wanita yang mengalami endometriosis dibandingkan wanita non-endometriosis. Ditemukan juga ekspresi VEGFR-2 pada pembuluh darah lebih tinggi pada wanita dengan endometriosis pada fase sekresi. Hal ini sejalan dengan penelitian Gagne et al. (2003) yang menjumpai ekspresi VEGF yang kuat pada lesi endometriosis terutama pada lesi merah (aktif) dibandingkan lesi hitam.

33,34

35,36

2.7.3 Hormon

Estrogen merangsang transkripsi gen VEGF-A dan menstabilkan mRNA VEGF-A sehingga memperlama waktu paruh transkripsi. Kelima regio

(46)

pengaturan VEGF-A masih belum ditemukan mengandung elemen yang langsung merespon estrogen, namun mengandung beberapa lokasi AP-1 dan Sp1, yang dapat memediasi kerja estrogen. Progestin juga meningkatkan ekspresi VEGF-A pada uterus manusia dan pada sel kanker payudara manusia (T47-D), terkait dengan aktivasi transkripsional gen VEGF.5,16,20

Pengaruh dari testosterone terhadap ekspresi VETGF-A juga telah diteliti pada lini sel kanker payudara pada tikus S115 yang tergantung androgen dan pada jaringan prostat manusia. Aktivasi transkripsional menyebabkan peningkatan dalam ekspresi VEGF-A termasuk stabilisasi dari mRNA. Bagian pengaturan dari gen VEGF ini tidak mengandung elemen yang berespon terhadap androgen atau gonadotropin. Namun demikian, reseptor androgen terikat ligand telah ditemukan dapat memodulasi transkripsi secara tidak langsung melalui faktor transkripsi lain, seperti kompleks AP-1.

5,20

2.7.4 Onco-genes dan tumor suppressor genes

Beberapa onkogen berperan dalam regulasi VEGF seperti c-src dan PI3/ras (gambar 2.2). Protoonkogen c-src mengkode protein tyrosine kinase,

yang terlibat dalam regulasi ekspresi VEGF dan dalam meningkatkan neovaskularisasi tumor yang sedang tumbuh. Ekspresi onkogen ras mutan merupakan salah satu perubahan genetik yang dideteksi menginduksi ekspresi VEGF. Aktivasi ras juga menjadi bagian dari rangkaian sinyal yang diawali beberapa reseptor faktor pertumbuhan seperti EGFR.16,29

(47)

Gambar 2.2. VEGF sebagai mediator angiogenesis dan faktor-faktor yang mempengaruhi ekspresi VEGF

Gen supressor tumor p53 merupakan salah satu gen supresor tumor yang paling intensif dipelajari dalam patogenesis tumor solid. Keterlibatan mutasi gen p53 dijumpai pada ekspresi fenotip tumor yang agresif dan invasif. Gen ini berperan penting dalam regulasi VEGF. Perubahan genetik yang terjadi pada p53 akan meningkatkan ekspresi VEGF dengan menginduksi aktivitas HIF-1.

2.8 Ekspresi Kuat VEGF 16,20,28,29

Ekspresi kuat VEGF telah dihubungkan dengan progresivitas tumor dan prognosis buruk dalam berbagai macam tumor, termasuk karsinoma kolorektal, karsinoma lambung, karsinoma pankreas, kanker payudara, kanker paru dan melanoma, myeloid leukemia, karsinoma hepar dan kanker ovarium. Penelitian oleh Matei et al. (2007) menjumpai 13 dari 21 kasus karsinoma ovarium (61%) yang diperiksa secara imunohistokimia menunjukkan pulasan sitoplasma positif kuat (+3) untuk ekspresi VEGF.22,37

(48)

Yamamoto dkk memanfaatkan pewarnaan immunohistokimia dan kadar serum, untuk meneliti hubungan antara ekspresi VEGF dalam neoplasma ovarian dengan faktor klinikopatologi. Pewarnaan positif diamati pada 97% kasus (68 dari 70 kasus) karsinoma ovarium dan 33% kasus (5 dari 15 kasus) cystadenoma jinak. Diantara pasien dengan karsinoma ovarium, pewarnaan immunohistokimia untuk faktor VEGF terkait dengan kelangsungan hidup yang kurang baik.

Fa”rkkila et al. (2011) melakukan pemeriksaan imunohistokimia pada jaringan tumor sel granulosa ovarium dari pasien yang didiagnosa sejak tahun 1965-2009 di Helsinki University Central Hospital. Dari 91 tumor sel granulosa, 65 (74%) menunjukkan pulasan kuat untuk VEGF, 23 (26%) pulasan lemah dan hanya 6 (7%) yang negatif terhadap antibodi VEGF. Hasil pewarnaan tersebut tersebar merata pada sel tumor dan lapisan endotel pembuluh darah tumor. Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan pentingnya peran VEGF dalam patologi tumor sel granulosa dan mendukung kemungkinan penerapan terapi berbasis target pada pasien dengan tumor sel granulosa.

Sebaliknya dari penelitian oleh Duncan et al. pada 339 kasus kanker ovarium primer, ekspresi kuat VEGF hanya dijumpai pada 7% dari seluruh kasus (22 kasus). Penelitian ini bertujuan menilai pola ekspresi VEGF dan perannya dalam menentukan prognosis pasien dengan kanker ovarium yang diperkirakan sesuai untuk mendapat terapi antiangiogenik. Penelitian ini akhirnya menyimpulkan tidak ada hubungan antara ekspresi VEGF dan varibel klinis sehingga peran antiangiogenik dinilai terbatas.

(49)

2.9 Terapi antiangiogenik

Terapi antiangiogenik termasuk kepada terapi berbasis target (targeted therapy). Targeted therapy bekerja dengan berbagai pendekatan yang berbeda, antara lain dengan pendekatan langsung yang mentargetkan antigen tumor untuk mengubah sinyalnya baik dengan antibodi monoklonal atau dengan obat-obat bermolekul kecil yang mampu menganggu protein target (gambar 2.3).38,39

Gambar 2.3. Berbagai pendekatan targeted therapy

Terapi antiangiogenik menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru, menginduksi apoptosis sel endotel, menghambat koorporasi sel progenitor endotelial dan hematopoietik ke dalam pembuluh darah dan normalisasi pembuluh darah. Oleh karena peran pentingnya dalam angiogenesis tumor, jalur VEGF/VEGFR telah menjadi fokus utama dalam pengembangan berbagai antikanker baru. Anti-VEGF bevazicumab (Avastin) telah banyak dievaluasi penggunannya sebagai agen tunggal atau dikombinasikan dengan kemoterapi pada kasus kanker. Agen anti-VEGF lainnya adalah aflibercept dan inhibitor reseptor tyrosine kinase.

(50)

2.9.1 Bevazicumab

Bevacizumab (Avastin, Genentech) adalah antibodi monoklonal rekombinan anti VEGF manusia. Bevacizumab merupakan immunoglobulin G(IgG) yang terdiri dari 2 rantai ringan yang identik, tersusun oleh 214 residu asam amino dan 2,453 residu rantai berat yang mengandung oligosakarida dan memiliki berat molekul sebesar 149-kDa.

Bevacizumab secara selektif berikatan dengan afinitas yang tinggi dengan segala bentuk isoform dari VEGF manusia dan menetralisir aktivitas biologis VEGF melalui penghambatan sterik ikatan VEGF pada reseptornya yakni Flt-1 (VEGFR-1) dan KDR (VEGFR-2) ada permukaan sel endotel. Aktivasi reseptor secara normal merangsang fosforilasi tyrosine dan beberapa rangkaian tranduksi sinyal yang meningkatkan mitogenik dan sinyal aktivitas pro survival untuk sel endotel pembuluh darah. Ekspresi reseptor VEGF sangat rendah pada jaringan normal tetapi pada jaringan pembuluh darah tumor terjadi up regulasi VEGF. Penetralan VEGF oleh bevacizumab memberikan penghambatan yang relatif spesifik terhadap pembentukan pembuluh darah baru pada tumor sehingga terjadi penghambatan terhadap pertumbuhan tumor dan proses terjadinya metastasis.

21,41

Penggunaan bevazicumab telah disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) pada tahun 2004 sebagai lini pertama pengobatan kanker kolorektal yang telah bermetastase. Tromboembolisme merupakan efek samping yang paling signifikan. Efek samping lainnya berupa perforasi gastrointestinal, hipertensi dan epistaksis.

21,38,41,42

(51)

Bevacizumab telah dievaluasi sebagai agen tunggal maupun dikombinasikan dengan kemoterapi pada pasien dengan kanker ovarium pada sejumlah uji klinis. Pada model kanker ovarium, penggunaan tunggal antibodi ini memberikan efek minimal pada massa tumor namun sangat mengurangi asites, sedangkan pada penggunaanya dikominasikan dengan paclitaxel, massa tumor serta asites berkurang signifikan.39,42

2.9.2 VEGF Trap (Aflibercept)

Salah satu cara efektif untuk menghambat jalur sinyal VEGF adalah dengan mencegah VEGF berikatan dengan reseptor normalnya dengan memberikan perangkap reseptor VEGF. Aflibercept (VEGF Trap) adalah perangkap reseptor terlarut yang merupakan gabungan protein yang mengandung domain pengikatan VEGF baik VEGFR-1 dan 2 yang dihubungkan melalui regio Fc dari IgG1 manusia. Aflibercept mengikat VEGF A dan menetralkan seluruh isoform VEGF A dan placental growth factor.27,30,38

Dalam suatu penelitian samar ganda tahap II pada pasien dengan kanker ovarium resisten platinum, 162 pasien diberikan dua tingkat dosis 2 mg/kg atau 4 mg/kg setiap 2 minggu.

Tingkat respons yang dinilai adalah 11%. Hipertensi adalah efek samping yang paling umum, namun mengingat tingkat respons yang rendah, aflibercept mungkin tidak akan digunakan sebagai agen tunggal dalam pengobatan kanker ovarium.

21.41

(52)

Molekul reseptor tyrosine kinases (TKIs) phosphorylate yang teraktivasi akan memicu penurunan jalur transduksi sinyal yang akan mempengaruhi proliferasi dan survival sel tumor. Mekanisme yang bergantung pada fosforilasi ini penting untuk memulai aktivitas growth factors seperti VEGF dan PDGF. Menghambat fosforilasi dengan menargetkan komponen intraseluler dari

tyrosine kinase sehingga menghambat aktivitas biologis VEGF, menjadikan hal ini salah satu strategi antitumor yang efektif.21,39,41

Hasil yang menjanjikan datang dari beberapa uji f ase II yang meneliti agen tunggal molekul TKI, yang mentargetkan VEGFR pada

kanker ovarium rekuren. Namun hasil penelitian dengan imatinib, suatu inhibitor PDGFR dan c-Kit, mengecewakan dengan aktivitas minimal sebagai agen tunggal. Kebanyakan toksisitas berkaitan dengan dosis berupa diare, kelelahan, dan lethargi. Oleh karena pemberiannya yang nyaman yaitu per oral, obat ini akan memainkan peranan penting dalam terapi pemeliharaan kanker ovarium lanjut.

(53)

2.10 Kerangka Teori

VEGF

Pembuluh Darah

Angiogenesis

Ketidakseimbangan anti dan proangiogenik

Progresivitas Metastase Prognosis

Permeabilitas Degradasi

Migrasi Anti apoptosis

Hipoksia Growth factors onco-genes dan

tumor suppressor genes

Hormon

Tumor ovarium

usia, usia menarche, status menopause, paritas, riwayat keluarga tumor ovarium

(54)

BAB III

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS

3.1 Kerangka Konsep

Karakteristik pasien

Variabel bebas

Variabel tergantung

Variabel-variabel penelitian meliputi :

− variabel bebas yaitu ekspresi VEGF (skala nominal)

− variabel tergantung yaitu tumor ovarium jinak (skala nominal), tumor ovarium ganas (skala nominal)

3.2 Hipotesis

tumor ovarium

ekspresi VEGF

Tumor ovarium ganas Tumor ovariumjinak

usia

status menopause paritas

(55)

− Ho : Tidak terdapat perbedaan ekspresi VEGF antara tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak.

Ha : Terdapat perbedaan ekspresi VEGF antara tumor ovarium ganas dan tumor ovarium jinak.

− Ho : Tidak terdapat hubungan antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas

Ha : Terdapat hubungan antara ekspresi kuat VEGF dengan kejadian tumor ovarium ganas

(56)

BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian analitik dengan pendekatan case control.

4.2 Tempat dan waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di departemen Obstetri dan Ginekologi. Pemeriksaan jaringan tumor ovarium dilakukan di departemen Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan. Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2013.

4.3 Populasi Penelitian 4.3.1 Populasi Target

Subyek penelitian adalah pasien dengan tumor ovarium di RSUP H. Adam Malik Medan.

4.3.2 Populasi Terjangkau

Pasien yang telah dioperasi dan jaringannya dilakukan pemeriksaan histopatologi.

(57)

4.4 Sampel dan besar sampel 4.4.1 Sampel

Sampel penelitian ini adalah populasi terjangkau yang diambil secara acak sederhana dengan penetapan kriteria inklusi dan kriteria eksklusi

4.4.2 Besar Sampel

2 2 2 1 2 2 1 1 2 1 ) ( ) 2 ( P P Q P Q P Z PQ Z n n − + + =

= α β

) ( 2 1 2 1 p p

P= +

dimana :

Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α yang

ditentukan. Nilai α = 0,05  Z_α Z

=1,96

β = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai β yang

ditentukan. Nilai β = 0,20  Z_β P

=0,84

1 = proporsi ekspresi VEGF (+) pada tumor ovarium ganas dari pustaka2 P

= 0,56 2 = proporsi ekspresi VEGF (+) pada tumor ovarium jinak2

= 0,20 1= 1- P1 = 0,44 Q2= 1- P2

P = (P

= 0,80

1 + P2 Q = 1 - P = 0,62

)/2 = 0,38

n1=n2

4.5 Kriteria inklusi dan eksklusi

= jumlah sampel = 21,9 orang ≈ 22 orang

(58)

− Memiliki hasil pemeriksaan histopatologi dari laboratorium PA RSUP H. Adam Malik yang membuktikan suatu tumor ovarium kecuali endometriosis

− Menjalani operasi di RSUP H. Adam Malik pada rentang waktu 1 januari – 31 desember 2012

4.5.2 Kriteria Eksklusi

− Blok parafin tidak tersedia

− Pemeriksaan imunohistokimia gagal

4.6 Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia 4.6.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, inkubator, staining jar, rak object glass, rak inkubasi, pensil

Diamond, pipet mikro, kertas saring, pengukur waktu, gelas erlenmenyer, gelas beker, tabung sentrifuge 15ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, coated object glass, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.

4.6.2 Bahan Penelitian

− Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin

− Pulasan imunohistokimia menggunakan metode Labelled Streptavidin Biotin

Immunoperoxidase Complex. Antibodi primer yang digunakan adalah

Monoclonal Mouse Anti-Human Vascular Endothelial Growth Factor Clone VG1 (Dako, Denmark), dengan pengenceran 1: 50.

− Larutan kromogen DAB yang digunakan adalah liquid DAB substrate kit (NCL-L-DAB) (Novocastra, Inggris): 3, 3’-diaminobenzidine.

− Larutan PBS (phosphate buffered saline) pH 7,2 − Larutan buffer sitrat (sodium citrate buffer) pH 9,0

(59)

− Blok parafin disimpan dalam lemari pendingin pada suhu -50

− Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator selama 18-20 jam dengan suhu 38º C

C, selanjutnya dipotong tipis menggunakan mikrotom dengan tebal 4µm dan ditempelkan pada coated object glass.

− Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat kedalam cairan xylol I, II, III masing-masing selama 5 menit

− Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98% sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, alkohol 90%, 80% dan 70%, masing-masing selama 5 menit.

− Bilas dengan air mengalir selama 5 menit − Masukkan kedalam H2O2

− Bilas dengan akuades selama 5 menit

0,3% dalam metanol dingin selama 15 menit

− Masukkan kedalam larutan buffer sitrat (yang telah dipanaskan sebelumnya dalam microwave selama 5 menit)

− Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan

− Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air disekitar potongan jaringan

− Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan pap pen

− Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit

− Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan blocking serum pada sediaan yang telah ditandai dengan pap pen selama 5 menit

− Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit

− Bersihkan dari sisa pencuci dan teteskan antibodi primer VEGF dengan pengenceran 1 : 50, inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit

− Bilas dalam larutan PBS sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit − Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan dengan antibodi sekunder,

Biotinylated Universal, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan

selama 10 menit

(60)

− Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan dengan steptavidin-peroxidase conjugate, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit − Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit

− Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan larutan kromogen DAB selama 5 – 10 menit

− Bilas dengan air mengalir selama 5 menit

−Counterstain dengan Hematoksilin Mayer selama 2 menit − Bilas dengan air mengalir

− Dehidrasi dengan cara: celupkan secara berurutan pada cairan alcohol 70%, 80%, 90% dan etanol 98% masing-masing 20 celup

− Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit − Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup

(61)

4.6.4 Instrumen Penilaian

Untuk penilaian, instrumen yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia terhadap antibodi VEGF sebagai berikut:

• Kontrol positif : endometrium yang telah diketahui positif terhadap VEGF • Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel tumor dan sel

endotel

Menurut Ravikumar et al. penilaian pemeriksaan imunohistokimia dilakukan berdasarkan intensitas pulasan dan persentase jumlah sel yang terpulas. Pulasan terhadap antibodi VEGF dominan dijumpai pada sitoplasma sel tumor. Nilai total merupakan jumlah dari skor (a) dan (b) dengan rentang 0-6 (tabel 4.1). Ekspresi VEGF dianggap kuat (overexpression) apabila total skor >2, ekspresi VEGF dianggap lemah jika total skor 0-2.44

Tabel 4.1 Histoscore VEGF untuk penilaian imunohistokimia

Pembacaan hasil pemeriksaan imunohistokimia dilakukan oleh spesialis PA.

Intensitas tampilan (a)

Skor Persentase sel terpulas fokal (b)

Negatif Lemah Sedang

Kuat

0 1 2 3

Negatif < 25% 26-50%

(1)

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

− Pada penelitian ini terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok penderita tumor ovarium jinak dan ganas berdasarkan rata-rata usia, sedangkan tidak dijumpai perbedaan yang bermakna antara kedua kelompok berdasarkan kategori, status menopause, usia menarche dan paritas.

− Jenis histologi serosum merupakan yang terbanyak ditemukan, baik pada kelompok tumor ovarium jinak maupun ganas.

− Terdapat perbedaan ekspresi VEGF pada sitoplasma sel tumor ovarium antara tumor ovarium ganas dan jinak

− Ekspresi kuat VEGF berhubungan dengan kejadian tumor ovarium ganas.

6.2 Saran

Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut, terutama untuk menilai hubungan ekpresi VEGF dengan stadium, respon terhadap kemoterapi dan tingkat ketahanan hidup penderita tumor ovarium ganas dalam upaya menilai prognosis dan mencapai strategi penatalaksanaan terbaik pada kasus tumor ovarium ganas.

DAFTAR PUSTAKA

1. Lengyel E. Ovarian Cancer Development and metastasis. The American Journal of Pathology, Vol. 177, No. 3, 2010.

2. Yamamoto S, Konishi I, Manda M, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in epithelial ovarian neoplasms: correlation with

(2)

clinicopathology and patient survival, and analysis of serum VEGF levels. British Joumal of Cancer (1997) 76(9), 1221-1227

3. Spannuth W, Sood A, Coleman R. Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy. Nature clinical practice oncology. April 2008. vol 5 no 4

4. Gubbels J, Claussen N, Kapu AK, et al. The detection, treatment, and biology of epithelial ovarian cancer. Journal of Ovarian Research. 2010,3:8 5. Hoeben A, Landuyt B, Highley M, et al. Vascular Endothelial Growth Factor

and Angiogenesis. Pharmacological reviews. Vol. 56, No. 4. 56:549–580, 2004

6. Amini A, Moghaddam S, Morris DL, et al. Utility of Vascular Endothelial Growth Factor Inhibitors in the Treatment of OvarianCancer: From Concept to Application. Hindawi Publishing Corporation. Journal of Oncology, Volume 2012

7. Tamsma JT, Keizer HJ. Meinders AE. Pathogenesis of malignant ascites: Starling's law of capillary hemodynamics revisited. Annals of Oncology 12: 1353-1357. 2001.

8. Schorge J,Schaffer J, Halvorson L, Hoffman B, et al.Williams Gynecology, McGraw Hill, 2008, chapter 35

9. Morrison PJ. Hodgson SV. Haites NE. Familial Breast and Ovarian Cancer Genetics, Screening and Management. Cambridge University. Press 2002 10. Bell R, Petticrew R, Luengo RM. Screening for ovarian cancer: a systematic

review. Health Technology Assessment 1998; Vol. 2: No. 2

11. Fa¨ rkkila A, Anttonen M, Pociuviene J. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor VEGFR-2 are highly expressed in ovarian granulosa cell tumors. European Journal of Endocrinology (2011)164115–122

12. Duncan TJ, Al-Attar A, Rolland P, et al. Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Ovarian Cancer: A Model for Targeted Use of Novel Therapies. Clin Cancer Res . 2008;14:3030-3035.

13. Alvarez AA, Krigman HR, Whitaker RS, et al. The Prognostic Significance of Angiogenesis in Epithelial Ovarian Carcinoma. Clin Cancer Res Vol. 5, 587– 591, March 1999.

(3)

14. Zweemer RP, Jacobs IJ. Familial Ovarian Cancer. Methods in Molecular Medicine, Vol. 39: Ovarian Cancer: Methods and Protocols . Humana Press 15. Reynolds RK. Overview of Gynecologic Oncology. Edisi 11. 2012

16. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor : basic science and clinical progress. Endocr Rev 2004;25:581-611

17. Pirtea L, Grigoras D, Ilina R, Raica M. Molecular Basis Of Angiogenesis In Ovarian Cancer. Journal of Experimental Medical & Surgical Research Year XVIII. Nr.1/2011. p 9 -13

18. Leary A, Gore M. Incorporating Bevacizumab into Ovarian Cancer Treatment: Practical Considerations. American Society of Clinical Oncology. 2011

19. Abulafia O, Sherer D. Angiogenesis of the ovary. Am J Obstet Gynecol 2000;182:240-6.

20. Roskoski R. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression. Critical reviews in Oncology/Hematology 62 (2007)179-213 21. Ferrara N, Hillan KJ, Novotny W. Bevacizumab (Avastin), a humanized

anti-VEGF Monoclonal Antibodi for Cancer Therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications 333 (2005) 328–335

22. Gerber HP, Ferrara N. Pharmacology and Pharmacodynamics of Bevacizumab as Monotherapy or in Combination with Cytotoxic Therapy in Preclinical Studies. Cancer Res 2005; 65: (3). February 1, 2005.

23. Murukesh N. Dive C. Jayson G. Biomarkers of angiogenesis and their role in the development of VEGF inhibitors. British Journal of Cancer (2010) 102, 8-18

24. Folkman J. A New Link in Ovarian Cancer Angiogenesis: Lysophosphatidic Acid and Vascular Endothelial Growth Factor Expression. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 93, No. 10, May 16, 2001

25. Dvorak HF. Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor: A Critical Cytokine in Tumor Angiogenesis and a Potential Target for Diagnosis and Therapy. J Clin Oncol 20:4368-4380. 2002.

(4)

26. Mesiano S, Ferrara N, Jaffe RB. Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Ovarian Cancer. American Journal of Pathology, Vol. 153, No. 4, October 1998

27. Campos SM, Ghosh S. A Current Review of Targeted Therapeutics for Ovarian Cancer. Hindawi Publishing Corporation Journal of Oncology Volume 2010, Article ID 149362. p :1-6

28. Jain RK, Duda DG, Clark JW. Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer. Nature clinical practice oncology. 2006 Vol 3. NO 1

29. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB jour. 1999 Vol.13

30. Willmott LJ, Fruehauf JP. Targeted Therapy in Ovarian Cancer. Hindawi Publishing Corporation Journal of Oncology Volume 2010, Article ID 740472, 1155/2010/74047

31. Baziad Ali. 2008, Endokrinologi Ginekologi. Edisi ketiga. Penerbit Media Aesculapius Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta, P: 1-31 32. Berbic M, Fraser I.S. 2011, Regulatory T cells and other leukocytes in the

pathogenesis of endometriosis, Elsevier vol 88: 149-55.

33. Artini P. G, Ruggiero M, Papini F,. et al. Endometriosis and Angiogenic Factors. Endometriosis - Basic Concepts and Current Research Trends. InTech. 2012

34. Sundqwist J. 2011, Pathophysiological factors and genetic association in endometriosis, Karolinska Institutet.

35. Bourlev V, Volkov N, Pavlovitch S, et al. The relationship between microvessel density, proliferative activity and expression of vascular endothelial growth factor-A and its receptors in eutopic endometrium and endometriotic lesions. Reproduction (2006) 132501–509

36. Gagne D, Page M, Robitaille G, et al. Levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) in serum of patients with endometriosis. Human Reproduction Vol.18, No.8 pp. 1674±1680, 2003

37. Matei D, Kelich S, Cao L. PDGF BB Induces VEGF Secretion in Ovarian Cancer.Cancer Biology & Therapy 6: 2007 Landes Bioscience

38. Wu HC, Chang DK, Huang CT. Targeted Therapy for Cancer.J. Cancer Mol. 2(2): 57-66, 2006.p 59-63

(5)

39. Tagawa T, Morgan R, Yen Y, et al. Ovarian Cancer: Opportunity for Targeted Therapy. Hindawi Publishing Corporation Journal of Oncology Volume 2012, Article ID 682480.p3-6

40. Dean E, El-Helw L, Hasan J. Targeted Therapies in Epithelial Ovarian Cancer. Cancers 2010, 2, 88-113

41. Teoh DGK, Secord AA. Antiangiogenic Therapies in Epithelial Ovarian Cancer. Cancer Control vol. 18, no.1. 2011

42. Burger RA. The Evolving Role of Antiangiogenetic Agents for Ovarian Cancer Therapy. Hongkong J Radiol. S12-8.2011;14

43. Kim A, Ueda Y, Naka T. Therapeutic strategies in epithelial ovarian cancer, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research2012,31:14

44. Ravikumar G, Crasta A. Vascular endothelial growth factor expression in ovarian serous carcinomas and its effect on tumor proliferation. South Asian Journal of Cancer. Vol 2,issue 2. 2013

45. Elvina M. Perbandingan efektivitas Risk of Ovarian Malignancy Algorithm (ROMA) dengan Risk of Maalignancy Index (RMI) untuk membedakan tumor ovarium epitel jinak dan ganas di RSUP H. Adam Malik Medan, Tesis Departemen Obstetri dan Ginekologi Universitas Sumatera Utara, 2013

46. Buzdar AU, Freedman RS. Cancer Care Series. 2006 Springer Science 47. Yip P, Chen T, Seshaiah P, et al. Comprehensive Serum Profiling for the

Discovery of Epithelial Ovarian Cancer Biomarkers. Plos one vol 6(12): 2011 48. Shen GH, Ghazizadeh M, et al. Prognostic significance of vascular

endothelial growth factor expression in human ovarian carcinoma. British Journal of Cancer(2000) 83(2), 196–203

(6)

HALAMAN PENGESAHAN

PENELITIAN INI TELAH DISETUJUI OLEH TIM – 5

Pembimbing :

Pembimbing I

dr. Deri Edianto, M. Ked(OG), SpOG(K) ...………... Tgl. 2013

Pembimbing II

dr. Muhammad Rusda, M. Ked(OG), SpOG(K) ...………... Tgl. 2013

Penyanggah :

Sub Divisi Fetomaternal

Dr. dr. Sarma N. Lumbanraja M.Ked(OG), SpOG(K) ...………... Tgl. 2013

Sub Div. Fertilitas & Endokrinologi Reproduksi

dr. Ichwanul Adenin M. Ked(OG), SpOG(K) ...………... Tgl. 2013

Sub Divisi Onkologi Ginekologi

dr. Edy Ardiansyah, M. Ked(OG), SpOG(K) ...………... Tgl. 2013

Perbedaan Dan Hubungan Ekspresi VEGF Antara Tumor Ovarium Ganas Dan Jinak