Bahan Penelitian − Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin Cara kerja
− Blok parafin disimpan dalam lemari pendingin pada suhu -5
− Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator selama 18-20 jam dengan suhu 38º C
C, selanjutnya dipotong tipis menggunakan mikrotom dengan tebal 4µm dan ditempelkan
pada coated object glass.
− Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat kedalam cairan xylol I, II, III masing-masing selama 5 menit
− Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, alkohol 90, 80 dan 70,
masing-masing selama 5 menit. − Bilas dengan air mengalir selama 5 menit
− Masukkan kedalam H
2
O
2
− Bilas dengan akuades selama 5 menit 0,3 dalam metanol dingin selama 15 menit
− Masukkan kedalam larutan buffer sitrat yang telah dipanaskan sebelumnya dalam microwave selama 5 menit
− Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan − Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air disekitar potongan
jaringan − Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan pap pen
− Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit − Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan blocking serum pada sediaan
yang telah ditandai dengan pap pen selama 5 menit − Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
− Bersihkan dari sisa pencuci dan teteskan antibodi primer VEGF dengan
pengenceran 1 : 50, inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit
− Bilas dalam larutan PBS sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit − Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan dengan antibodi sekunder,
Biotinylated Universal, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan
selama 10 menit − Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
− Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan dengan steptavidin-peroxidase conjugate,
inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit − Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
− Bersihkan dari sisa cairan pencuci dan teteskan larutan kromogen DAB selama 5
– 10 menit − Bilas dengan air mengalir selama 5 menit
− Counterstain dengan Hematoksilin Mayer selama 2 menit − Bilas dengan air mengalir
− Dehidrasi dengan cara: celupkan secara berurutan pada cairan alcohol 70,
80, 90 dan etanol 98 masing-masing 20 celup − Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit
− Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup