2.7.2 Dehidrasi dehydration
Jaringan yang telah difiksasi akan mempertahankan kandungan air yang tinggi, suatu kondisi yang menjadi penghambat untuk proses selanjutnya,
sehingga jaringan perlu didehidrasi. Cairan dalam jaringan dapat menyebabkan jaringan lunak, berisi lumen atau celah cekung dan mudah rusak oleh penyayatan.
Penghilangan air dari jaringan biasanya dicapai dalam suatu rangkaian larutan alkohol dengan persentase yang meningkat secara bertahap, yakni 30, 50,
70, 80 dan 95 dan alkohol absolut yang bertujuan untuk mengurangi penyusutan pada jaringan. Jika tahap dehidrasi tidak dilakukan dalam suatu
rangkaian, maka dapat dilakukan dengan langkah 30 dan 80 alkohol, dan penggantian tetap 50. Waktu yang dibutuhkan untuk setiap tahap bergantung
pada ukuran objek yakni ½ jam hingga 2 jam, 3 jam untuk kasus yang ekstrim. Penggantian kedua dari alkohol absolut harus dapat menghilangkan air dengan
sempurana Humason 1967. Sampel yang difiksasi dengan Formalin, Alkohol, Asam asetat glasial FAA mulai didehidrasi dalam alkohol 50 Sass 1951.
Dehidrasi dengan Tertiary Butyl Alkohol TBA merupakan metode yang lebih memuaskan. Setiap tingkatan dari dehidrasi TBA membutuhkan waktu minimal 1
jam. Rangkain tersebut kemudian diikuti dengan 100 TBA murni yang dilakukan sebanyak 3 kali Johansen 1940.
2.7.3 Penjernihan clearing, infiltasi, penanaman embedding dengan
metode parafin
Hidrokarbon benzene, toluene dan xylene merupakan reagen, umumnya digunakan untuk tujuan penjernihan. Jika selama penjernihan, zat penjernih
benzene, toluene dan xylene menjadi keruh menunjukkan bahwa air masih ada dalam jaringan dan jaringan tidak terdehidrasi dengan sempurna. Hal ini dapat
dilakukan pengulangan ke dalam alkohol absolut. Penjernihan menghilangkan atau menjernihkan jaringan yang tidak tembus cahaya menjadi transparan
Humason 1967.
2.7.4 Penyayatan sectioning dan penempelan sayatan
Material siap disayat apabila parafin telah membeku. Blok jaringan dipotong dengan pisau tajam. Panjang blok kurang dari 2 cm dan dimensi blok
11
dibedakan dengan bentuk seperti empat persegi panjang. Blok parafin ditanamkan di atas blok kayu. Faktor yang mempengaruhi penyayatan adalah kualitas parafin,
infiltrasi yang tepat, orientasi penempelan material, kekakuan penempelan, suhu, kekerasan atau kerapuhan material. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan
mikrotom Sass 1951.
2.7.5 Pewarnaan staining
Sebelum sayatan dapat diwarnai parafin harus dihilangkan dengan menggunakan xilol. Slide ditempatkan pada rak dan dimasukkan dalam wadah
xilol selama 5 menit, xilol hendaknya dapat menutupi slide. Slide kemudian dipindahkan dalam campuran etanol absolut dan xilol dengan jumlah yang sama.
Pemindahan selanjutnya dilakukan ke dalam campuran alkohol absolut dan eter selama 5-10 menit. Slide lalu diangin-anginkan hingga sayatan menunjukan tanda
keputih-putihan. Slide kemudian dimasukkan dalam serangkaian alkohol, dimulai dengan 95, 70, 35 masing-masing 5 menit Johansen 1940.
Toluidine blue merupakan salah satu zat warna yang tergolong dalam golongan pewarna kationik yang bersifat basa. Sel mast akan teramati cukup jelas
pada pewarnaan toluidine blue dibandingkan dengan pewarnaan lainnya misal alcian blue dan alcian blue-safranin Agung dan Kazutaka 2011. Zat pewarna ini
dapat bereaksi spesifik untuk komponen-komponen penyusun sel tumbuhan. Toluidine blue biasanya digunakan untuk mengidentifikasi sel mast dan pengujian
kandungan lignin. Selain itu juga digunakan untuk mengidentifikasi makromolekul karbohidrat. Penggunaan pewarna ini biasanya untuk pewarnaan
bagian jaringan semi tipis yang berukuran 0,5 sampai 1pM. Pewarnaan toluidine blue dilarutkan ke dalam buffer McIlvaine pada pH 4,0. Setelah diwarnai preparat
dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah selesai dilakukan pewarnaan kemudian slide ditetesi dengan Canada Balsam dan ditutup dengan cover slip.
Canada Balsam digunakan untuk merekatkan objek dengan slide dan cover glass agar objek tidak berpindah-pindah. Preparat kemudian siap untuk diamati
dengan mikroskop Agung dan Kazutaka 2011. 12
3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu
Kategori