4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak etanol daun trengguli ditambah 300 mL air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak :
washbensin 2:1, vv, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil ekstraksi cair-cair tersebut diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi washbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi lagi menggunakan etil
asetat dengan perbandingan larutan fraksi air-etil asetat 1:1, vv sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan
dengan vacuum rotary evaporator. Fraksi yang telah kering digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.
5. Pembuatan Larutan DPPH, baku pembanding, larutan uji
a. Pembuatan larutan DPPH. 15,8 mg DPPH dilarutkan ke dalam metanol.
Diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan dibuat selalu baru.
b. Pembuatan larutan stok kuersetin. 2,5 mg stok kuersetin ditimbang dan
ditambahkan metanol hingga 10 mL. c.
Pembuatan larutan seri kuersetin. Diambil 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; dan 0,6 larutan stok kuersetin dan diencerkan dengan metanol hingga 10 mL pada labu ukur, dan
akan diperoleh larutan dengan kadar 5; 7, 5; 10; 12,5; 15 gmL.
d. Pembuatan larutan uji dari ekstrak etanol fraksi etil asetat. Sebanyak 25 mg
ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol sampai 25 mL dan didapat konsentrasi 1 mgmL. Larutan tersebut diambil 5 mL lalu diencerkan ke 50 ml. Dari
larutan intermediet diambil sebanyak 3; 4,75; 6; 8,25, dan 10 mL lalu diadd dengan metanol hingga 10 mL, sehingga didapat konsentrasi 30; 47,5; 60; 82,5, dan 100
gmL.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik. Sejumlah larutan asam galat dan larutan uji dimasukkan masing-
masing dalam tabung reaksi dan ditambahkan reagen Folin Ciocalteu 110 vv, Larutan tersebut ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah 10 menit
warna larutan diamati. b.
Uji aktvitas antioksidan. Sebanyak 2 mL larutan DPPH, dimasukkan dalam masing-masing tiga labu takar berukuran 10 mL. Metanol sebagai kontrol, larutan
kuersetin konsentrasi 15 µgmL, dan larutan uji konsentrasi 100 µgmL dibuat pada labu takar 10 mL. Selanjutnya diencerkan dengan metanol hingga tanda batas.
Larutan tersebut divortek 30 detik. Selama 30 menit diamati perubahan warna yang terjadi.
7. Optimasi uji daya antioksidan
a. Penentuan OT Operating Time. 2 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke
dalam labu takar sebanyak tiga buah, masing-masing berukuran 10 mL, kemudian masing-masing tabung ditambahkan dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5;
10; dan 15 µgmL kemudian ditambahkan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut divortek selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometri visible pada panjang gelombang 517 selama 1 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari larutan uji fraksi etil asetat pada konsentrasi
30, 65, dan 100 µgmL. b.
Penentuan panjang gelombang maksimum. Pada tiga labu takar berukuran 10 mL, dimasukkan masing- masing 0,2; 0,6; dan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM. Tiap
labu takar tersebut ditambahkan metanol hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,02; 0,06; dan 0,08 mM Larutan tersebut divortek 3 detik. Larutan
kemudian didiamkan selama OT. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang antara 400-600 nm.
8. Penentuan aktivitas antioksidan
Kategori