10; dan 15 µgmL kemudian ditambahkan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut divortek selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometri visible pada panjang gelombang 517 selama 1 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari larutan uji fraksi etil asetat pada konsentrasi
30, 65, dan 100 µgmL. b.
Penentuan panjang gelombang maksimum. Pada tiga labu takar berukuran 10 mL, dimasukkan masing- masing 0,2; 0,6; dan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM. Tiap
labu takar tersebut ditambahkan metanol hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,02; 0,06; dan 0,08 mM Larutan tersebut divortek 3 detik. Larutan
kemudian didiamkan selama OT. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang antara 400-600 nm.
8. Penentuan aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol. Pada labu takar 10,0 mL,
dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM kemudian ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan
panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan
larutan uji. b.
Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji. Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing masing labu takar 10,0 mL
kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri
konsentrasi larutan yang telah dibuat. Selanjutnya ditambahkan metanol p.a. hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30 detik dan diamkan selama
OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan. Hasil dari prosedur 7a dan b
divalidasi berdasarkan presisi CV, linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol.
9. Optimasi penentuan fenolik total
a. Penentuan OT Operating Time. Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi
50; 100; dan 150 µgmL dalam metanol. Masing-masing larutan diambil 0,5 mL dan ditambahkan dengan reagen Folin Ciocalteu serta 4 mL larutan natrium karbonat 1
M. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 750 nm selama 30-60 menit. Operating time ditentukan ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum. Dibuat larutan baku asamgalat
dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 µgmL dalam metanol. Masing-masing diambil sebanyak 5 mL dan ditambahkan dengan reagen Folin Ciocalteu yang telah
diencerkan dengan air serta 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Sampel didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
10. Penetapan kadar fenolik total
