diperoleh florotanin kasar yang akan menjadi analit untuk ditetapkan kadar polifenol totalnya dengan menggunakan reagen fenolik Folin-Ciocalteau.
D. Dasar Reaksi Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau
Reagen yang digunakan adalah Folin-Ciocalteau F-C yang dalam kondisi stabil sebelum reaksi berwarna kuning dalam suasana asam. Reaksi F-C ini
melibatkan reaksi antara ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asam- asam fosfomolibdat dan fosfotungstat Anonim, 2006.
Warna biru produk berasal dari oksidasi fenolat, dan asam heteropoli tereduksi secara parsial dari +6 menjadi campuran kondisi valensi +6 dan +5
menghasilkan produksi kompleks molibdenum-tungsten biru Singleton Rossi, 1965. Bagian reagen yang paling aktif dari reagen ini adalah molibdat sehingga
kompleks warna yang terbentuk disebut molybdenum blue. Dalam bentuk tunggal, molibdat akan menjadi sukar larut dan
membentuk koloidal Auterhoff Knabe, 1978. Oleh karena itu, molibdat dicampur dalam bentuk garam NaMolibdat dan diberikan asam fosfat H
3
PO
4
membentuk kompleks asam fosfomolibdat. Selain kompleks dengan fosfat, diketahui bahwa senyawa seperti arsenat, wolframat, silikat juga mampu
membentuk kompleks asam dengan molibdat. Misalnya, jika membentuk kompleks dengan arsen maka kompleks asam yang terbentuk disebut
arsenomolibdat. Reagen aktif F-C tersusun atas larutan asam berwarna kuning yang
mengandung kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam heteropoli
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Singleton Rossi, 1965. Asam heteropoli yang ada pada reagen F-C adalah asam tungstat dan asam molibdat.
Kenyataanya reagen ini mengandung seri atau rangkaian polimerik yang memiliki bentukan umum dengan pusat atau sentral unit tetrahedral fosfat PO
4 3-
dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum Singleton
Rossi, 1965. Florotanin berupa polimer dengan unit monomernya floroglusinol
memiliki 3 gugus hidroksil. Gugus hidroksil ini cukup reaktif dan merupakan pengarah orto, para dalam proses sintesis. Ketiga gugus hidroksil floroglusinol
berada pada posisi meta, sehingga posisi orto dan para masih kosong dan akan mudah dioksidasi sehingga posisi posisi para, orto terisi oleh gugus hidroksil
juga. Florotanin dan polifenol lainnya sangat tidak stabil dalam kondisi basa karena akan teroksidasi membentuk ion fenolat C
6
H
6
O
-
dan berlanjut akan membentuk senyawa kuinoid yang dapat membuat warna pigmen semakin intens
biasanya berwarna kecoklatan. Susana basa saat reaksi diberikan oleh natrium karbonat, sehingga semua
senyawa fenolik akan teroksidasi menjadi ion fenolat. Dan ion fenolat inilah yang akan mereduksi kompleks asam heteropoli dari fosfotungstat dan fosfomolibdat
membentuk produk berwarna biru. Reduksi yang sempurna dari reagen ke status valensi yang lebih rendah
merusak warna asalnya. Sifat alamiah sesungguhnya dari complex blue pigments hingga saat ini masih belum dapat dipastikan. Prinsip pembentukan pigmen biru
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ini digunakan dalam analisis sebagai metode kolorimetri yang sudah lama diketahui Singleton Rossi, 1965. Warna biru yang dihasilkan setara dengan
konsentrasi fenolat yang terbentuk artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak pula ion fenolat yang terbentuk dan reagen F-C
semakin rusak oleh reduktor dan warna biru yang dihasilkan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat sehingga dapat dianalisis dengan spektrofotometer.
Kompleks asam dari reagen F-C ini akan tereduksi membentuk produk yang berwarna dengan adanya suatu reduktor. Reagen F-C sendiri dapat bertindak
sebagai agen pengoksidasi oksidator.
Reaksi Reduksi asam fosfomolibdat:
H
3
PMo
12
O
40
+ 4e + 4 H
+
H
7
[PMo
12
O
40
]
Auterhoff Knabe, 1978 Reaksi Oksidasi fenol:
OH O
O
+ H
2
O + 4 H
+
+ 4e
C
6
H
5
OH C
6
H
4
O
2
oksidator
McMurry, 2004 Saat analisis terjadilah kesetimbangan reaksi redoks dari reagen F-C dan
senyawa fenolik gambar 10.
OH O
O
+ H
2
O
C
6
H
5
OH C
6
H
4
O
2
+ H
3
PMo
12
O
40
H
7
[PMo
12
O
40
] +
senyawa biru
Gambar 10. Reaksi redoks dalam reaksi Folin-Ciocalteau
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gugus fenol teroksidasi dengan cepat dalam larutan cukup basa dan menghasilkan ion-ion fenolat dalam konsentrasi cukup. Reagen F-C dan pigmen
biru yang terbentuk tidak stabil dalam larutan basa. Reaksi melibatkan pengrusakkan reagen kuning yang aktif. Kebanyakan senyawa fenolik terionisasi
sekitar 50 pada pH 9-10. Karena porsi yang terionisasi bereaksi dengan reagen folin kesetimbangan akan bergeser dan akan lebih banyak lagi fenolat yang
dihasilkan. Dibutuhkan waktu untuk reaksi ini untuk dapat mendekati sempurna. Reagen F-C harus tetap bertahan dalam kondisi basa, agar dapat bereaksi dengan
semua fenolat. Untuk pertimbangan ini dibutuhkan kondisi optimum untuk alasan produksi reaksi yang cepat dan retensi waktu yang panjang untuk warna
maksimum akan mencakup pertimbangan reagen fosfo-molibdo-tungstat kadar tinggi dan alkalinitas yang sedang Singleton Rossi, 1965.
Terdapat banyak variasi dalam penggunaan metode Folin-Ciocalteau ini sendiri. Variasi yang ada mencakup perbedaan dalam pemilihan referensi standar,
lama pemanasan reaksi, suhu, dan perbedaan hasil pengukuran panjang gelombang Anonim, 2006. Referensi standar yang umum digunakan untuk
analisis kandungan polifenol adalah asam galat, asam tanat, keursetin yang umum digunakan untuk sampel flavonoid dan floroglusinol.
Alasan pemilihan standar floroglusinol adalah karena secara teoritis floroglusinol merupakan unit monomer florotanin alga. Diperkuat oleh hasil
penelitian Zhang et al. 2006, didapat hasil pembacaan panjang gelombang maksimum produk berwarna kebiruan dari metode Folin-Ciocalteau, pada sampel
alga A. nodosum dan baku floroglusinol sama-sama berada pada panjang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
gelombang 750 nm atau adanya kesamaan karakteristik antara florotanin dengan baku floroglusinol saat direaksikan dengan reagen F-C.
E. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau
