24
DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA USU
3.3.2. Penghitungan Sel Bakteri
Di laboratorium semua sampel kteri di simpan dalam lemari es ± 4
°
C. Dari setiap sampel dibuat pengenceran berseri dalam larutan garam fisiologis 0,9 ,
kemudian 0.1 ml larutan disebar pada media Plate Count Agar PCA untuk menghitung sel bakteri, kemudian media differensial dan selektif untuk mendapatkan bakteri patogen
oportunistik. Isolasi E. coli dengan menyebar 0,1 ml kultur pada media Eosin Metilen Blue EMB, Salmonella pada Salmonella-Shiegela agar, Staphyloccoccus aureus pada
media Manitol Salt Agar. Konsentrasi sel pada masing-masing media selektif dihitung dalam CFUml
.
Isolat dimurnikan melalui penggoresan pada media SWC, kemudian koloni tunggal digores pada media SWC miring dan disimpan dalam lemari es sampai
digunakan. Alur kerja penghitungan sel bakteri dapat dilihat pada Lampiran 3 pada halaman 51.
3.3.3. Pembentukan dan Penghitungan Sel Biofilm
Lempeng stainless stell SS dipotong seluas 1 cm
2
, dicuci dengan deterjen tergazyme pada bak sonikator kemudian dibilas dengan akuades, disterilkan dengan
autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm, suhu 121
°
C. Lempeng ini akan digunakan untuk substrat pelekatan biofilm. Masing-masing isolat murni bakteri uji ditumbuhkan pada 100
ml media SWC dengan konsentrasi sel 10
8
CFUml, dalam labu Erlenmeyer 250 ml, setelah itu 6 lempeng SS dimasukkan ke masing-masing media pengkulturan tersebut
kemudian digoyang pada kecepatan 120 rpm water bath shaker pada suhu ruang 28°C. Pembentukan biofilm dilihat pada periode waktu 1, 3, dan 6 hari untuk melihat
perkembangan sel. Lempeng diangkat dari kultur, dibilas dengan larutan NaCl 0,9 dimasukkan ke 9 ml buffer fosfat yang ditambah dengan 1 gram manik-manik kaca glass
bead kemudian divortek untuk melepas sel biofilm. Sebanyak 0,1 ml kultur dalam NaCl fisiologis 0,9 sebagai pengencer kemudian disebar pada PCA, diinkubasi selama 24 jam
pada suhu ruang kemudian dilakukan penghitungan. Ulangan penghitungan dibuat sebanyak 3 kali Jamilah et al, 2004. Alur kerja pembentukan dan penghitungan sel
biofilm dapat dilihat pada Lampiran 4 pada halaman 53.
3.3.4. Kurva Pertumbuhan Bacillus sp.
Sebanyak 2 koloni biakan Bacillus sp. berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam 100 ml media SWC pada Erlenmeyer 100 ml, sambil digoyang dengan Water Bath
Shaker dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 3 jam diambil 10 ml dan diukur absorbansi sel pada panjang gelombang 620 nm Bintarti, 2008. Kemudian dibuat kurva
Universitas Sumatera Utara
25
DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA USU
pertumbuhannya. Alur kerja pembuatan kurva pertumbuhan Bacillus sp. dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 54.
3.3.5. Uji Tantang Sel Bacillus sp. Terhadap Bakteri Uji
Disediakan masing-masing kultur bakteri patogen oportunistik umur 24 jam pada larutan NaCl 0,9 10 ml dengan kepadatan sel 10
7
CFUml, diambil dan disebar pada media SWC padat menggunakan cotton bud steril. Diusapkan hingga merata menutupi
media. Disediakan kultur Bacillus sp. umur 24 jam pada larutan NaCl fisiologis 0,9 10 ml dengan kepadatan sel 10
7
CFUml. Diletakkan kertas cakram d=6 mm pada petri yang telah ditetesi sebelumnya dengan 100 µl kultur Bacillus sp. Alur kerja uji tantang sel
Bacillus sp. terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Lampiran 6 pada halaman 55.
3.3.6. Uji Penghambatan Senyawa Antimikroba Ekstrak Kasar Bacillus sp.
Terhadap Bakteri Uji
Bakteri uji yang dipanen setiap 3 jam disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit suhu 4°C untuk memisahkan supernatan dari masa sel. Supernatan bebas
sel yang diperoleh dari masing-masing sampel diuji aktivitas antimikrobanya. Sebanyak 10 µl supernatan diteteskan pada 3 kertas cakram steril diameter 6 mm yang diletakkan
di atas permukaan media SWC yang telah disebar 1 ml kultur cair bakteri uji kepadatan 10
7
CFUml. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 33°C selama 24 jam dan dilakukan pengukuran diameter zona bening yang berbentuk di sekitar kertas cakram Valestine,
2009. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 7 pada halaman 56.
3.3.7. Pengontrolan Sel Biofilm Patogen Oportunistik dengan Senyawa Antimikroba
